[发明专利]一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及羽叶三七中鲨烯环氧酶基因的克隆和应用，

背景技术

羽叶三七(Panax japonicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus(Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng)属于五加科人参属(Panax L.)植物，是传统的名贵药材之一，具有较高的药用价值，如清热解毒、顺气健胃、活血祛疲、滋补强壮等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。

羽叶三七是中国药典收载品种,具有广阔的应用前景和可观的经济价值,目前中国羽叶三七的野生资源近于濒危，通过研究羽叶三七中活性成分三萜皂苷类化合物的生物合成途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。

鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，SQE)基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用。SQE通过在C-C之间插入1个氧原子催化角鲨烯生成中间体单氧态角鲨烯，此中间体在强光和紫外线的作用下可生成2，3-氧化角鲨烯。而2，3-氧化角鲨烯是三萜类化合物——植物甾醇、达玛烯二醇、环阿乔醇的前体，其合成直接关系羽叶三七中三萜类皂苷的含量，目前，SQE被公认为是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶之一。

本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行羽叶三七全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到羽叶三七中编码鲨烯环氧酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能。为羽叶三七三萜皂苷化合物的生物合成提供理论基础。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其氨基酸序列。此基因编码的鲨烯环氧酶在羽叶三七中三萜皂苷化合物的生物合成的过程中具有重要的作用，本专利认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来研究羽叶三七中三萜皂苷化合物生物合成的关键点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因，其序列为SEQ ID N O.1所示。该基因被公认为是人参属植物活性成分三萜皂苷合成的关键基因，进而为人参属植物中三萜皂苷含量的提高提供技术手段。

本发明的另一个目的是提供羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示，

本发明的最后一个目的在于提供羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因在在提高羽叶三七中三萜皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到羽叶三七中，可提高羽叶三七中三萜皂苷的含量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因(以下称为PjSQE基因)，其制备方法如下：

以羽叶三七的cDNA文库为模版，引物P1:5'ATGGAACTCGGGAGGAGTT3'；引物P2:5'TTACATTTTTTTAGTAATGG3'；PCR反应条件:94℃预变性5min；94℃变性1min,52.6℃退火50s,72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

最终获得了PjSQE基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因在提高三萜类皂苷的含量中的应用，其应用过程如下：

将羽叶三七鲨烯环氧酶蛋白质(SEQ ID NO.2所示)对应的PjSQE基因(优选SEQ I D NO.1所示的核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入羽叶三七，可获得高三萜皂苷含量的的转基因植株。

本发明的所要保护的内容还包括：

编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含有本发明的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pC AMBIA系列载体，pRTL。

含有本发明的羽叶三七鲨烯环氧酶(PjSQE)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围，包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、羽叶三七细胞或羽叶三七发根细胞。