[发明专利]藏菖蒲快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNPs位点鉴定藏菖蒲的方法。

背景技术

藏菖蒲(Acorus calamus L.)是天南星科菖蒲属多年生草本植物，在亚洲、欧洲和北美洲均有分布。作为藏族习用药材，藏菖蒲具有驱虫、抗菌、减脂、抗癌、抗糖尿病、抗炎、免疫调节、祛痰、防辐射等多种药理作用，同时对消化系统和神经系统也有明显的作用。但是其毒性也不容小觑，作为活性成分的β-细辛醚和α-细辛醚有“三致”(致癌、致畸、致突变)毒性。正因为如此，美国FDA(Food and Drug Administration)明令禁止食用藏菖蒲及其提取物。藏菖蒲(Acorus calamus L.)与本身变种(Acorus americanus)、同属植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)、金钱蒲(Acorus gramineus Soland.)、香叶菖蒲(Acorus xiangyeus)、茴香菖蒲(Acorus macrospadiceus)、宽叶菖蒲(Acorus latifolius)亲缘关系很相近，属易混淆品。另外，藏菖蒲、水菖蒲、石菖蒲等在药材市场上叫法较乱，存在同物异名和同名异物的现象。鉴于传统的性状鉴别对藏菖蒲与其近缘种的鉴定比较困难，尤其对于药材市场存在的藏菖蒲切片等的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将藏菖蒲药材、饮片加以鉴定区分。

发明内容

本发明第一个目的在于提供藏菖蒲鉴定用SNPs标记。

本发明第二个目的在于提供藏菖蒲鉴定用SNPs标记在藏菖蒲鉴定中的应用。

本发明第三个目的在于提供藏菖蒲快速鉴定方法

本发明提供的藏菖蒲鉴定用SNPs标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位藏菖蒲为C，其他物种为T；第205位藏菖蒲为G，其他物种为C或T。

本发明提供的SNPs可用于鉴定藏菖蒲，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第205位为G，则鉴定为藏菖蒲，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为T、第205位为C或T，则待鉴定样品不是藏菖蒲。

本发明提供的藏菖蒲鉴定方法，其包括如下步骤：

1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整ITS2内转录间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位和第205位的碱基。

其中，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第23位为C和/或第205位为G，则鉴定为藏菖蒲，否则不是藏菖蒲。

本发明扩增时使用的引物序列为：

ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′

上述引物用于扩增藏菖蒲的ITS2序列。

本发明还提供含有上述引物的藏菖蒲鉴定试剂盒。

本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的藏菖蒲任何样品。因此，能够实现藏菖蒲原植物与近缘种、药材、生饮片与混淆品的快速、准确鉴定。

附图说明

图1所示为藏菖蒲ITS2序列的扩增结果(1-11分别代表样品YC0046MT04-YC0046MT14)。

图2所示为藏菖蒲SNPs位点整体缩略图。

图2.1所示为藏菖蒲SNPs位点图(1-46bp)

图2.2所示为藏菖蒲SNPs位点图(176-215bp)

图3所示为C1主导变异和次要变异的种内变异序列(C1为藏菖蒲种内占99.19％的主导变异，C2为次要变异)。

图4所示为多拷贝峰图(C1主导变异峰图，C2次要变异峰图，在变异位点处可见多拷贝峰图)。

图5所示为藏菖蒲及混伪品NJ树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1藏菖蒲药材原料的鉴定方法