[发明专利]抑藻活性物质灵菌红素及其制备方法

权利要求书

1.Hahella sp.KA22，已于2014年06月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014297。

2.抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于所述抑藻活性物质灵菌红素的分子式为C₂₀H₂₆ON₃，结构式为：

相对分子量为323；

所述制备方法包括以下步骤：

1)将Hahella sp.KA22纯化后的菌株接种于新鲜海水配制的固体2216E平板上，于恒温培养箱中培养，挑取固体2216E平板上的单菌落接种于新鲜海水配制的2216E液体培养基中培养后，即得发酵液；所述Hahella sp.KA22，已于2014年06月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014297；

2)将步骤1)所得发酵液离心，去除上清留下菌体，用酸性甲醇萃取，将甲醇萃取液旋转蒸干，再加入与甲醇等体积的乙酸乙酯，静置后将乙酸乙酯萃取液旋转蒸干，去除杂质；

3)将步骤2)得到的乙酸乙酯萃取物溶于1mL甲醇中，上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱进行初步分离，洗脱流动相采取100％甲醇，得到红色组分A1，黄色组分A2；将红色组分A1和黄色组分A2旋转蒸干，溶解于DMSO中，验证抑藻活性；

4)将活性组分用1mL乙酸乙酯溶解，上样与硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱；

5)收集不同颜色的组分得到黄色组分B1，红色组分B2，粉红色组分B3，将黄色组分B1、红色组分B2和粉红色组分B3旋转蒸干，溶解于DMSO中，验证抑藻活性；

6)将活性组分溶解于乙酸乙酯，利用薄层层析分析，采用紫外显色，碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，确定活性组分纯度；

7)将活性组分上样与硅胶柱采用流动相梯度浓度洗脱；

8)收集不同颜色的组分得到黄色组分C1和红色组分C2，将黄色组分C1和红色组分C2旋转蒸干，再溶解于DMSO中，验证抑藻活性。

3.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述于恒温培养箱中培养的温度为28℃，培养的时间为24h。

4.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述于新鲜海水配制的2216E液体培养基中培养的条件是于28～37℃，180～250rpm培养2d。

5.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述离心的条件是于10,000～12,000g离心10min；所述酸性甲醇的用量按体积比可为菌体的30倍；所述静置的温度可为4℃；所述杂质中包括大量蓝黑色物质及其他杂质。

6.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述硅胶柱采用170mm×30mm，200～300目硅胶柱。

7.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述流动相梯度浓度为：(a)正己烷洗脱2个柱体积；(b)正己烷∶乙酸乙酯＝8∶1，按体积比计算，洗脱2个柱体积；(c)正己烷∶乙酸乙酯＝6∶1，洗脱2个柱体积；(d)正己烷∶乙酸乙酯＝5∶1，洗脱4个柱体积；(e)正己烷∶乙酸乙酯＝3∶1，洗脱2个柱体积；(f)用乙酸乙酯洗脱2个柱体积。

8.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述硅胶柱采用170mm×30mm，500目硅胶柱。

9.如权利要求2所述抑藻活性物质灵菌红素的制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述流动相梯度浓度为：(a)正己烷洗脱2个柱体积；(b)正己烷∶乙酸乙酯＝8∶1，按体积比计算，洗脱2个柱体积；(c)正己烷∶乙酸乙酯＝6∶1，洗脱2个柱体积；(d)正己烷∶乙酸乙酯＝5∶1，洗脱4个柱体积；(e)正己烷∶乙酸乙酯＝3∶1，洗脱2个柱体积；(f)用乙酸乙酯洗脱2个柱体积。