[发明专利]一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用。 

背景技术

随着血清多肽组学的快速发展，血清多肽类标志物所揭示的生物信息对于肿瘤的辅助诊断已引起研究人员的极大关注，传统中被人们认为是“生物垃圾”的血清多肽已变身为“诊断黄金”。基于多肽标志物的肿瘤诊断技术开始向临床应用转变。同时，一些多肽的联合应用有可能为肿瘤等重大疾病的早期诊断提供革新性的突破，如Villanueva等利用血清多肽研究了前列腺癌、乳腺癌以及膀胱癌，寻找到了几十个可作为肿瘤标志物的多肽片段，对样本的预测准确率达到100％。 

高分子量激肽原(High MolecμLar Weight Kininogen.缩写为HWMK或HK)是血浆中的一种糖蛋白，分子量120kDa，其分子可划分为6个结构域，其中D1、D2和D3组成分子的重链，D4含有缓激肽肽段，D5和D6区组成分子的轻链。HK被激肽释放酶活化，释放D4区的缓激肽并产生双链高分子激肽原(HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。HK转变为HKa后，发生较大的构像变化，使D5区暴露更加明显，D5是HKa的活性中心，发挥HKa的主要作用，如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长与转移等。目前，有研究报道HKa蛋白可用于肿瘤的早期诊断。多肽标志物HKP09和HKP15由HKa代谢产生，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D5区，具体位于497～511位氨基酸，命名为HKP09。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区，具体位于HKa蛋白的381～389位氨基酸，命名为HKP15。实验证实它们在肿瘤样本中的含量显著(P<0.001)高于正常样本，可用于肿瘤或肝硬化的早期诊断。 

多肽-前体蛋白标志物是前体蛋白降解后，多肽标志物未与蛋白完全解离的形式。其中，多肽标志物通过化学键牢固存在于前体蛋白上，且多肽标志 物与前体蛋白的抗原决定簇显著不同。HKP09/HKP15-HKa即为HKa降解后，多肽标志物HKP09和HKP15未与其完全解离的形式。采用多肽及其前体蛋白两种特异性抗体，对多肽-前体蛋白进行定量检测，可以更精确的反映样品中标志物的表达情况，更加精确的区分肿瘤样品与正常人样品。 

当前用于血清多肽标志物研究的检测技术主要包括免疫质谱法(Immuno-MS)、化学发光法(CLIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)。免疫质谱法具有极高的检测灵敏度，如本发明人已公布的专利CN102507936A利用多抗免疫质谱技术检测到目标多肽标志物的峰值比理论峰值的偏差小于0.3Da。化学发光法通过所检标志物与特异性抗体结合，再利用抗体上标记的酶催化底物自身发光，根据发光值的高低来实现生物标志物的定量，灵敏度要明显比ELISA高。酶联免疫吸附法作为一种经典的免疫学检测技术，具有操作简单、研发时间较短、试剂稳定、成本较低的优势，检测特异性和灵敏度也满足临床需求。基于产品的稳定性和市场适用性，CLIA和ELISA已相继开发出相关的多肽和蛋白标志物联合检测的诊断试剂产品，且多采用双抗体夹心检测模式。 

对于血清多肽标志物来说，必须要考虑到多肽的分子量普遍偏小(大部分在5KD以下)，空间结构单一，相应的抗原表位少，免疫原性低等不足，因此多肽抗体的制备难度明显高于蛋白抗体。更进一步，在筛选抗多肽的单克隆细胞株时，考虑到上述不足因素的限制，更加难以制备出针对同一多肽不同抗原表位的特异性抗体，从而限制了对2个或2个以上多肽标志物的同步检测。 

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，与多肽标志物HKP09和HKP15均特异性结合。 

本发明提供了一种单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.9331的杂交瘤细胞株3D11分泌产生，与两种多肽HKP09和HKP15特异性结合，HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 

本发明中的多肽标志物包含HKP09和HKP15。这两个标志物存在大多数多肽标志物所共同的缺陷：分子量小、空间结构单一、抗原表位单一，免疫原性差，不易制备单克隆抗体或制备出的单克隆抗体灵敏度、低特异性不强，且未有一种抗体可同时与多肽HKP09和HKP15特异性结合的报道。