[发明专利]一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法

权利要求书

1.一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：具体方法如下：

1）取10mL水样加入30mg EDTA钠盐，充分溶解，NaOH调节pH值为6.0，室温反应24小时；

2）在酶标板上加入浓度为1.0μg/mL的Cd²⁺-ITCBE-OVA，每孔50μL，37℃温育2小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

3）用5%猪血清封闭酶标孔，每孔250μL，37℃温育1小时，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

4）每孔加入50μL工作浓度的Cd²⁺-EDTA单抗，同时加入等体积的待测样品及不同浓度的Cd²⁺标准品与EDTA的鳌合物，设阴性和空白对照，37℃温育15分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

5）加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔50μL，37℃温育25分钟，PBST洗板3次，每次间隔3分钟；

6）加入TMB底物液，每孔100μL，室温显色5分钟；

7）加入终止液，每孔100μL，酶标仪读取A_450nm值；

8）结果判定：以吸光率B/B₀为纵坐标，B是Cd²⁺不同浓度时Cd²⁺-EDTA的A_450nm值，B0是Cd²⁺0浓度时Cd²⁺-EDTA的A_450nm值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，进行回归分析，根据各样品的B/B₀值在标准曲线上求出其对应的质量浓度。

2.根据权利要求1所述的一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：所述的Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原的制备方法如下：将20mg BSA和OVA分别溶于1mL pH8.0的HEPES缓冲液(10mM/L)中形成20mg/mL的载体蛋白溶液； Cd²⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液与载体蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入分子量为8000～14000透析袋中透析5天，形成Cd²⁺-ITCBE-OVA检测抗原。

3.根据权利要求1所述的一种水样中镉离子污染阻断ELISA检测法，其特征在于：所述的Cd²⁺-EDTA单克隆抗体的制备方法为：

1）用Cd²⁺-ITCBE-BSA背部、皮下、多点以50μg /只·0.2 mL的剂量免疫Balb/C小鼠5只，共免5次，每次间隔4周，最后1次免疫后10 d断尾采血分离血清；

2）用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，采用间接ELISA检测免疫小鼠抗血清效价；将乙二胺四乙酸钠盐(EDTA)溶液与不同浓度梯度的Cd²⁺标准溶液混合，调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，制成Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液做为抑制剂，采用阻断ELISA试验检测免疫小鼠抗血清的敏感性；

选择抗血清效价高、并且抗血清对Cd²⁺-EDTA鳌合物的50%抑制浓度(IC₅₀)低的小鼠用Cd²⁺-ITCBE-BSA进行尾静脉超免；

3）无菌手术摘取超免小鼠的脾脏，制成脾细胞溶液；用分子量为1500的50%的聚乙二醇将脾细胞与与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例进行细胞融合，将融合后的细胞加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃ 5% CO₂培养箱中培养；

4）用Cd²⁺-ITCBE-OVA为包被抗原包被酶标板，以Cd²⁺-EDTA鳌合物溶液以及汞、铬、铅、锌、铜、铯、钴、钼、铁与EDTA的鳌合物溶液和EDTA溶液做为抑制剂，采用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选；选择效价高、抑制效果好、特异性强、细胞生长旺盛的孔采用有限稀释法进行克隆化；对单克隆细胞孔采用间接ELISA和阻断ELISA进行筛选，并对阳性单克隆细胞进行扩大培养；

5）给腹腔注射液体石蜡10 d后的小鼠腹腔注射克隆化特异性强的阳性杂交瘤细胞株10⁷个细胞，7 d后抽取腹水，提纯后即为抗Cd²⁺-EDTA鳌合物腹水型单克隆抗体。