[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的人A群链球菌快速检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌(groupAstreptococci，GAS)(M1，3，5，6，24血清型)抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

链球菌广泛分布于自然界和动物体内，可长期寄居于人体鼻咽部和肠道中。为革兰氏阳性菌，呈球状或卵圆形，为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求较高。链球菌种类繁多，根据溶血能力分为α、β、γ溶血性链球菌，又称之甲型、乙型、丙型溶血性链球菌。根据链球菌胞壁所含多糖(C抗原)的不同分为A～V等20族(其中缺I和J)，(Lancefield分型)。对人类有致病性的链球菌90％属于A群。链球菌C抗原的外层还具有M、T、R、S4种型特异性抗原。M抗原主要见于A群，根据M抗原的不同又可分为90多个血清型，其中在我国能引起风湿热的临床上最常见的血清型为M1，M3，M5，M6，M18，M24等。A群链球菌(groupAstreptococci，GAS)又称化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)，为β溶血性链球菌。A群链球菌感染和后遗症一直是困扰公共健康和国民经济的严重问题，尤对儿童和青年影响最大。A群链球菌感染最常发生于冬春季和雨季，在儿童发病年龄多见于5～15岁，临床可把A群链球菌感染分为四类：①浅表部位感染：咽炎、皮肤和软组织感染、脓疱疮、丹毒、阴道炎、产后感染；②深部感染：菌血症、坏死性筋膜炎、深部组织感染、蜂窝织炎、肌炎、脓毒败血症、心包炎、脑膜炎、肺炎、化脓性关节炎；③毒素介导：猩红热、链球菌中毒性休克综合征；④免疫介导：风湿热、链球菌感染后肾小球肾炎、反应性关节炎。

临床病人由于不同的呼吸道病原体(如副流感病毒、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。

尽管A群链球菌在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，A群链球菌的检测主要有以下几种方法：

一、常规实验室检测

1、细菌分离

细菌培养是诊断A群链球菌感染的“金标准”。样本采集后最好立即接种到血琼脂培养基上。若无条件及时接种，应使用转运培养基。将标本接种在血琼脂平皿，35～37℃，含有5％～10％CO₂或厌氧条件下孵育，可增加A群链球菌的分离率。血琼脂平皿孵育24～48h。A群链球菌菌落常不能与其他β一溶血性链球菌区别，特别是C群和G群，需采用血清学方法进行最后鉴定。该法培养所需时间长，操作步骤繁多，且若采样前患者使用过抗菌药物，会造成培养结果的假阳性。这样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。

2、血清学检测

即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫荧光法等，检测被检者血清中A群链球菌抗体水平，可间接提示A群链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人A群链球菌抗体效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，临床上主要检测的抗体为抗链球菌素O，而统计学研究表明大约20％的病人并不出现出现抗链球菌素O水平的升高，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。

二、快速诊断

直接检查人A群链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长(2h以上)，成本较高等缺点。PCR法主要是检测链球菌特异性rRNA序列，其检测快速、灵敏、特异，是目前研究A群链球菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。目前，检测人A群链球菌抗原的方法主要为胶体金法检测其C多糖抗原，但是胶体金法敏感度较低，对样品材料质量要求较高，同时在检测前还必须对样品进行细胞裂解以释放C多糖，而添加细胞裂解液的量又对检测灵敏度有较大的影响。因此，建立具备高灵敏度的A群链球菌特异性抗原快速诊断法十分必要。

发明内容

针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人A群链球菌(M1，3，5，6，24血清型)抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。