[发明专利]一种从阿胶中提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA提取方法，特别涉及一种从阿胶中提取DNA的方法。

背景技术

阿胶是脊索动物门哺乳纲马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶块，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，已有2000多年的历史。由于阿胶功效独特，供不应求，各地均出现其他动物皮熬制的代用品，给医药市场带来了混乱。为了鉴别市场所售的阿胶成分，目前较前沿的鉴别方法是分子鉴定，即将阿胶的DNA提取出来，用分子学手段检测所提取DNA的动物来源，以此确定阿胶的真伪。但由于阿胶本身属于蛋白质成分高，且粘性大的物质，使DNA提取不易，而且阿胶在制作过程中，原料经反复熬煮，致使DNA部分遭到破坏，更增加了阿胶DNA提取的难度。

目前从阿胶中提取DNA的方法主要依据为行标SDS法(中华人民共和国农业行业标准NY/T 674-2009)，经实验，该DNA提取方法对阿胶样品中DNA的提取率非常低，往往在抽提蛋白时，将DNA一起带走，导致提取DNA的结果不佳，不能够进行后续的实验工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经济、便捷、易行的从阿胶中提取DNA的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种从阿胶中提取DNA的方法，包括以下步骤：

1)向200mg粉碎后的阿胶中加入0.9～1.1mL SDS提取/裂解缓冲液并搅拌均匀得混合液A，向混合液A中加入95～105mg/mL的蛋白酶K水溶液后混合均匀得混合液B，加入的蛋白酶K水溶液与SDS提取/裂解缓冲液的体积比为0.9～1.1:20；将混合液B于67.5～68.5℃温浴1.4～1.6h得混合液C；

2)向混合液C中加入0.9～1.1倍混合液C体积的平衡酚后颠倒混匀，然后离心，收集离心得到的上层水相得料液A1；向料液A1中加入0.9～1.1倍料液A1体积的平衡酚后颠倒混匀，然后离心，收集离心得到的上层水相得料液A2；

3)向料液A2中加入0.9～1.1倍料液A2体积的溶剂A后颠倒混匀，然后离心，收集离心得到的上层水相得料液B1；向料液B1中加入0.9～1.1倍料液B1体积的溶剂A后颠倒混匀，然后离心，收集离心得到的上层水相得料液B2；向料液B2中加入0.9～1.1倍料液B2体积的溶剂A后颠倒混匀，然后离心，收集离心得到的上层水相得料液B3，溶剂A为平衡酚与氯仿的混合物，溶剂A中平衡酚：氯仿的体积比为25:24；

4)向料液B3中加入0.9～1.1倍料液B3体积的溶剂B后颠倒混匀，然后离心，收集离心得到的上层水相得料液C1，溶剂B为氯仿与异戊醇的混合物，溶剂B中氯仿：异戊醇的体积比为24:1；

5)利用乙醇沉淀法处理料液C1，使料液C1中的DNA沉淀，然后依次经过分离、洗涤以及干燥获得DNA。

所述步骤2)至步骤4)中，离心的条件为：10000g以及4℃下离心10～15min。

所述步骤5)具体包括以下步骤：

a)将料液C1、0.09～0.11倍料液C1体积的5mol/L乙酸钾水溶液和1.9～2.1倍料液C1体积的质量分数为96％的乙醇水溶液混合，然后于-19～-21℃静置过夜，然后离心，倾倒离心得到的上清，得沉淀A；

b)用499-501μL质量分数为70％的乙醇水溶液洗涤沉淀A，然后离心，倾倒离心得到的上清，得沉淀B；

c)将沉淀B于22～27℃干燥1～2h，然后用99～101μL无菌去离子水溶解，溶解后于4℃保存备用。

所述步骤a)中，离心的条件为：10000g以及4℃下离心10～15min。

所述步骤b)中，离心的条件为：12000g以及4℃下离心10～15min。

本发明的有益效果体现在：

本发明规定了最适阿胶的酶解时间及酶的用量等酶解条件，既保证了酶解的效果又合理的节约了时间，不造成经济浪费；在提取过程中，通过改进平衡酚、平衡酚-氯仿、氯仿-异戊醇等溶剂的使用顺序，控制使用酚类有机溶剂对样品的洗脱次数，使得蛋白类杂质除去干净，而又不使溶剂本身给系统中带来新的杂质，既使阿胶中DNA最大限度的被提取出来，又不增加本身体系中酚类等小分子杂质的含量；利用本发明所述方法可提取得到阿胶中所含有的DNA，提取得到的DNA总量大、纯度高，可以满足中药材分子鉴定对于DNA样品的高质量要求，且方法简单、经济、易于操作，提高了阿胶分子学鉴定的可靠性和效率。

附图说明