[发明专利]一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及是一种在肝素钠生产过程中去除细菌内毒素的方法。

背景技术

肝素钠(Heparin Sodium)是含有硫酸酯的粘多糖，属于不均一的多糖分子。分子结构用一个四糖重复单位表示如下：

肝素钠的分子量在8000—24000范围内，是从健康生猪小肠黏膜中提取的由两种多糖交替链接而成的多聚体，目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其它多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作用。

由于肝素钠结构复杂，目前还无法人工合成，中国生猪屠宰量占全球50％以上，拥有全球最丰富的肝素钠原料资源，我国是全球肝素钠粗品和肝素钠原料药的主要生产国，也是全球最大的肝素钠原料药出口国，拥有美国FDA认证或欧盟CEP认证标准的肝素原料药已呈现供不应求的局面。

肝素钠原料药来源于肝素钠粗品，含有大量杂质蛋白、杂质核酸、微生物等杂质，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素钠，从而制成肝素钠原料药。从上游企业收购来的肝素钠粗品中普遍都含有大量的细菌内毒素，细菌内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液则会引起不同的疾病，内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起发热反应--“热原反应”，因此注射用药物必须经过细菌内毒素检测合格后才能使用。中国药典2010、欧洲药典8.0、美国药典USP35-NF30均对肝素钠中细菌内毒素给出了要求，分别为≤0.010EU/IU、≤0.01EU/USP U和≤0.03EU/USP U。但是目前还没有相关的专利或文献报道通过有效的方法来控制肝素钠中细菌内毒素这一项指标。

发明内容

本发明的目的是为了克服肝素钠中细菌内毒素超标的问题，提供了一种在将肝素钠粗品制备成肝素钠原料的工艺过程中，采用添加高氯酸盐并辅以其他手段有效的去除肝素钠中的细菌内毒素的方法。本发明通过在制备肝素钠原料过程中加入高氯酸盐、调节适宜的反应温度和时间以及在其他条件的相互配合作用下，达到去除肝素钠中细菌内毒素的目的。该方法具有条件温和、操作简便、成本低、效果好的优点，适于肝素钠原料工业化生产。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法，其包括如下步骤：

(1)取含有细菌内毒素的肝素钠粗品用纯化水溶解，调节肝素钠水溶液的pH值为8.0-9.0，在70-85℃下加入高氯酸盐或其水溶液并进行反应；

(2)待反应结束后将反应液降温至20-30℃，向其中加入乙二胺四乙酸，搅拌使其反应，然后通过硅藻土过滤，滤液再进行超滤；

(3)超滤得到的肝素钠浓缩液升温至45-55℃，加入乙醇，搅拌后降温至10-15℃进行静置或离心，然后除去上清液；

(4)向步骤(3)得到的下层沉淀物中加入纯化水和氯化钠溶解沉淀物，然后在45-55℃下加入乙醇并搅拌后降温至10-15℃进行静置或离心，除去上清液，得到去除了细菌内毒素的肝素钠。

本发明所指的肝素钠粗品是指含有细菌内毒素的各种纯度的肝素钠，一般其细菌内毒素含量在10EU/USP U以上，抗Ⅱa效价≥110USP U/mg。

在步骤(1)和步骤(4)中测试的细菌内毒素方法为：取细菌内毒素国家标准品(简称RSE)1支，按照说明书复溶，漩涡混匀至少15min后，然后用鲎试剂将细菌内毒素工作标准品稀释成4λ、2λ浓度的内毒素溶液。在进行每一步稀释前，至少混合30s。精密称取供试品200mg，根据样品检测得到的效价，用鲎试剂将样品稀释成6IU/ml(2C)、3IU/ml(C)浓度的供试品溶液，按照欧洲药典的凝胶法进行操作；