[发明专利]一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用

说明书

技术领域

本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用。

背景技术

肌卫星细胞是一种起源于胚胎中胚层的肌源性干细胞，它的激活、增殖和分化是骨骼肌细胞增大、数目增多及肌纤维转化的重要基础。骨骼肌是鱼肉组成的主要成分，水产养殖的效益源于鱼类骨骼肌的快速增长，故骨骼肌生长和正常发育对于鱼类养殖发展是很重要的。肌卫星细胞的体外培养是了解骨骼肌细胞增殖、分化和再生机理的重要手段和技术，可以籍此研究和了解鱼类肌纤维发生分化与相关功能基因时空表达的内在联系以及相关调节因子的作用机制，从而促进鱼类肌肉速生快长；鱼类肌卫星的更新和激活分子机理研究，也有助于获得促进鱼类肌肉生长的新的技术方法。但与其他脊椎动物相比，有关鱼类肌肉卫星细胞研究甚少，尤其是经济鱼类的肌肉卫星细胞系及相关研究几乎未见报道。牙鲆(Paralichthysolivaceus)俗称牙片鱼、偏口鱼、比目鱼，隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲽形目、鲽亚目、牙鲆科、牙鲆属。其肉质鲜嫩，是一种名贵的海水经济鱼类，也是日本、韩国以及我国的重要海水增养殖鱼类之一。体外分离培养得到的牙鲆肌卫星细胞将成为研究牙鲆肌肉分化途径及性状改良分子机制的重要研究平台。

迄今，见诸报道的仅有大鼠、兔、猪、鸡等非鱼类的肌卫星细胞分离培养方法，其操作繁琐、容易污染，且在保持肌卫星细胞较长时间的生存和增殖能力方面存在不确定性，也不太适合鱼类肌卫星细胞培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便的牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种牙鲆肌卫星细胞系建立方法，将牙鲆肌肉组织经原代培养和传代培养，继而构建细胞系；

其中，原代培养，将0.5-1g靠近尾部的骨骼肌肉组织块充分剪碎后加入到细胞培养液中悬浮，而后将肌肉组织块悬液于25±0.2℃下正置培养，待组织块完成贴壁后再补加0.5-1mL细胞培养液；

传代培养，待上述经原代培养的组织块周围细胞迁出并增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25％胰蛋白酶消化液使细胞悬起得细胞悬液，而后利用细胞培养液进行原瓶传代培养,待原瓶传代细胞长满瓶底后，将其用0.25％胰蛋白酶消化液消化悬起后细胞悬液与新鲜细胞培养液按1：1-1：2(v/v)的比例分瓶传代，以后7天传代一次，15代后每3-5天传代一次，进而细胞系建立成功。

所述细胞培养液为在MEM培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，pH值为7.0-7.4，于4℃下保存，备用。

所述牙鲆可以由其它海水或淡水鱼类所替换。进一步的说是半滑舌鳎、大菱鲆或圆斑星鲽。

所述骨骼肌肉组织块为将牙鲆骨骼肌组织置于细胞培养液中3-5min后，吸出培养液，用1.0-1.2mLPBS(pH7.2)反复冲洗骨骼肌组织，再吸出PBS，将肌肉组织剪成小块，待用。所述肌肉组织为约1mm³大小的小块。

所述原代培养组织块周围细胞迁出并增殖至形成巢式细胞晕时，吸出培养液，用PBS(pH7.2)冲洗，吸出PBS，加入0.25％胰蛋白酶液消化，而后显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞变圆，在原瓶中加入细胞培养液使细胞悬浮，而后将悬液进行传代。

一种用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物，用于鉴定鱼类肌卫星细胞标记基因的特异性引物为，正向引物(F)TACTAGTGCTCGCCTGACATG；反向引物(R)TCAATCCTTAAACAATGCTGG。所述鱼类为牙鲆。

一种用于鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物的应用，所述特异性引物用于制备定性和/定量检测牙鲆肌卫星细胞标记基因的试剂盒。

本发明所具有的优点和积极效果如下：

1.本发明构建方式所涉及组织块培养法不仅能克服因两步酶消化法引起的细胞完整性破坏而导致的细胞功能紊乱和大量成肌细胞被消化的弊端，且其操作简便，更适宜鲆鲽类甚至于其他海水、淡水鱼类的肌卫星细胞培养。