[发明专利]具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白

说明书

本申请是2009年8月11日提交的题为“具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白”的中国专利申请200910221476.7的分案申请。

相关申请

本申请要求以2008年8月11日递交的美国临时申请号61/188,549和2009年4月16日递交的美国临时申请号61/212,812为优先权的权益。上述临时申请在此均全文引入作为参考。

发明领域

本发明涉及修饰的免疫球蛋白结合蛋白，例如葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A，其具有改进的免疫球蛋白结合特异性，以及制备和应用该蛋白的方法。

背景

葡萄球菌蛋白A(SpA)，是一种来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的42kDa的多域蛋白。SpA通过其羧端的细胞壁结合域被结合到细菌的细胞壁上，该结合域被称为X结构域。在氨基端的结构域，其包括5个免疫球蛋白结合区，被称为E、D、A、B和C区(Sjodhal,Eur J Biochem.Sep；78(2):471-90(1977)；Uhlen等人,J Biol Chem.Feb 10；259(3):1695-702(1984))。上述每个结构域包含大约58个氨基酸残基，且它们具有65-90％的氨基酸序列同一性。SpA的Z结构域是一个工程化了的SpA的B结构域的类似物，其在第29位上包括一个丙氨酸来替代甘氨酸残基。

基于SpA的试剂在生物技术领域具有广泛的应用，例如，在捕获和纯化抗体的亲和层析以及抗体的检测方法等方面。目前，基于SpA的亲和介质可能是应用最广泛的亲和介质，其用于从不同样品，包括细胞培养中进行单克隆抗体及其片段的分离。相应地，包括蛋白A配体的各种基质可以在市场上购买到，包括例如，-vA High Capacity，vA Ultra、UltraPlus(Millipore)和Protein A Sepharose^TM，MabSelect^TM，MabSelect Xtra^TM以及MabSelect(GE Healthcare)。

发明概述

本发明至少部分提供新的改进的SpA变体，其相对于以前所知的SpA变体表现出或者降低、或者升高的结合免疫球蛋白Fab部分的能力，同时保留其结合免疫球蛋白Fc部分的能力。

在一些实施方式中，本发明提供新的改进的SpA变体，其相对于市场上可购买到的很多基于蛋白A的Fab结合试剂表现出降低的Fab结合活性，而后者的Fab结合活性在有些时候是人们所不希望的。

在一个实施方式中，根据本发明的免疫球蛋白结合域是基于SpA的一个或多个结构域(即E、D、A、B、C和Z)，其被修饰为至少替换第29位的氨基酸。对于E、D、A、B和C结构域而言，第29位的氨基酸是甘氨酸，其被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸。对于结构域Z而言，第29位的氨基酸是丙氨酸，其被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一个特定的实施方式中，第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸，或者第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸。

相应地，在一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的E区，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，E区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。

在另一个实施方式中，提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白，其包括至少SpA的D区，其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基，且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性，而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白，其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中，D区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。