[发明专利]病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及环肽疫苗及其制备方法，具体地说，涉及一种病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法。

背景技术

根据肽键的结构可将多肽分为直链肽和环肽。其中直链肽的研究最为广泛和深入，虽然许多直链肽在体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后因体内环境复杂，存在各种各样的酶，导致直链肽在酶的作用下很快降解，活性丧失；另外，直链肽在液相里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求，这些不利因素造成多肽疫苗仍有许多问题有待解决。而环肽因其具有明确的固定构象，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在游离的氨基端和羧基端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，因此其生物活性半衰期长，受体选择性高，使得环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。

病毒性心肌炎是指病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，属于感染性心肌疾病。柯萨奇病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，是一种常见、多发的心血管系统疾病，目前尚无有效的预防或治疗疫苗。

多肽疫苗具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌、抗寄生虫感染功能。由于多肽疫苗价廉、安全、特异性强、容易保存和应用的优点，越来越受到重视。但也因其免疫原性差、功效低以及在体内易降解和不可复制性等不足影响了免疫效果。

CVB3为球形二十面体对称无包膜病毒，其核衣壳由4种多肽VP1、VP2、VP3和VP4共60个结构蛋白组成，其中VP1为CVB3的主要结构蛋白。研究表明VP1中含有多个可能的B细胞表位和T细胞表位，具有较强的免疫原性，是其主要的中和抗原，可诱导机体产生保护性免疫应答，因此VP1是相对最好的预防或治疗CVB3型病毒性心肌炎的疫苗候选靶抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型有效的病毒性心肌炎环肽疫苗。

本发明的另一目的是提供制备病毒性心肌炎环肽疫苗的方法。

为了实现本发明目的，本发明的B3型柯萨奇病毒VP1环肽，其是通过蛋白质内含子反式剪接将B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1环化，即得VP1环肽。

本发明还提供上述VP1环肽的制备方法，将B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1基因与蛋白内含子基因融合表达，以大肠杆菌为宿主，通过蛋白质内含子反式剪接将线状VP1蛋白环化获得VP1环肽。

本发明中涉及的蛋白内含子包括但不限于Rma DnaB intein等任一可将VP1成功环化的蛋白内含子。

具体地，前述制备方法包括以下步骤：

1)将Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列Ic及下游外显子第一个氨基酸残基Ser的编码基因序列(Ic+Ser)与VP1编码基因的5′端融合，将Rma DnaB intein第1-105位氨基酸的编码基因序列I_N与VP1编码基因的3′端融合；

2)将融合蛋白的编码基因在大肠杆菌体内诱导表达，通过Rma DnaB intein的Ic和I_N的反式剪接将VP1蛋白的N末端和C末端通过肽键连接形成VP1环肽；

3)VP1环肽以包涵体形式存在于大肠杆菌内，裂解细胞后通过变性法以His-tag标签纯化得到VP1环肽。

前述的制备方法，在37℃下诱导表达融合蛋白可使VP1的环化效率达到100％。

通过蛋白质内含子反式剪接制备环状VP1蛋白的示意图见图7。

本发明还提供病毒性心肌炎环肽疫苗，其是将所述B3型柯萨奇病毒VP1环肽任选辅以药用赋形剂和/或佐剂组成。所述环肽疫苗可以为液体剂型或冻干剂型。

本发明还提供上述环肽疫苗的制备方法，其是将所述B3型柯萨奇病毒VP1环肽任选与药用赋形剂和/或佐剂混合。

本发明还提供一种融合蛋白Ic-VP1-I_N，其中，VP1为B3型柯萨奇病毒结构蛋白，Ic为Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列及下游外显子第一个氨基酸残基Ser，I_N为Rma DnaB intein第1-105位氨基酸序列。

本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有编码上述融合蛋白Ic-VP1-I_N的基因。

本发明还提供含有编码上述融合蛋白Ic-VP1-I_N的基因的宿主细胞、转基因细胞系及工程菌。