[发明专利]植酸酶变体

说明书

技术领域

本发明涉及植酸酶变体，编码植酸酶变体的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列及其应用。

背景技术

在谷物和豆类中，磷主要以植酸或植酸盐(Phytate)的形式储存。植酸又称肌醇六磷酸，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸。

磷是动物生长的必需元素。单胃动物如猪、家禽和鱼不能直接吸收植酸盐，导致大量植物来源的磷元素排放于环境中，造成环境富营养化。同时，动物吸收磷酸盐不足会影响生长，为了补偿这些动物的磷酸盐的缺乏，需在饲料中补充磷酸盐，增加了养殖成本并加剧了对环境的不利影响。通过在动物饲料中使用植酸酶，水解了植酸盐，可改善动物对磷的吸收，并降低磷排放。因此，植酸酶具备一举两得的功效，已在动物饲料中普遍应用，具有十分重大的经济价值。

自然界中植酸酶的来源多种多样。通过基因工程手段，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶大规模廉价生产和实际应用成为可能。现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于细菌的植酸酶两种。其中来源于黑曲霉的植酸酶PHYA具有高耐热性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。

在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90℃的造粒过程。黑曲霉来源的植酸酶耐热性良好，能够抵抗住上述短时高温过程。但由于黑曲霉来源的植酸酶比活性较低，相比细菌来源的植酸酶比活性相差较大，因此进一步提高黑曲霉来源的植酸酶的比活性从而提升发酵活力，是饲用植酸酶的研究热点之一。同时，进一步提升耐热性，降低造粒时的酶活损失，也是饲用植酸酶的重要研究方向。

附图说明

图1显示含本发明所述植酸酶变体的重组载体pPHYA(即pPICZα-phyA)。

图2显示来源于黑曲霉的野生型植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1。括号内为植酸酶的原始信号肽序列，不含在本发明范围之内，字母带框的为突变位点。

图3显示编码植酸酶氨基酸序列SEQIDNo:1的经密码子优化的核苷酸序列，所述植酸酶从第20位氨基酸开始，不含信号肽序列。

发明内容

本发明通过基因突变的方法对黑曲霉来源植酸酶的氨基酸序列进行改造，使改造后的植酸酶具有提高的比活性或者耐热性能。构建表达载体和菌株，使改造后的植酸酶高效表达，最终达到工业化生产的要求。

本发明是以黑曲霉植酸酶PHYA为起始植酸酶进行突变筛选。来源于黑曲霉的植酸酶PHYA基因全长1401bp(GeneBank号码:P34752)，编码467个氨基酸(参见例如SEQIDNO:1中所示)。N端的19个氨基酸为信号肽，去除信号肽的黑曲霉植酸酶可以利用毕赤酵母进行分泌表达获得具有植酸酶活性的成熟蛋白。

在一个实施方案中，本发明的植酸酶变体，相对于野生型植酸酶的氨基酸序列SEQIDNo:1而言，具有选自以下的至少一个位点的氨基酸修饰：位点51、84、86、91、126、165、202、211、和300。优选地，所述的氨基酸修饰选自：Y51S,T(Y51S,T表示第51位的氨基酸残基Y优选S或T进行替换，以下同)；A84R,S,G；Y86P,G,W；K91N,T,V,A,G,S,M；D126E,N；R165K,W；E202D,Q；D211K；和K300E,G,L,I,V,M。