[发明专利]基于硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法

权利要求书

1.一种硝酸盐还原酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达硝酸盐还原酶的大肠杆菌；

所述的胞内硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1硝酸盐还原酶编码基因，由硝酸盐还原酶催化亚基SG‐NA和电子转移亚基SG‐NB构成，其核苷酸序列分别为2394bp和2127bp，分别编码797和708个氨基酸，其中：硝酸盐还原酶催化亚基SG‐NA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；硝酸盐还原酶电子转移亚基SG‐NB的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日。

3.一种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码硝酸盐还原酶催化亚基及电子转移亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体pETDuet‐1，最终获得重组共表达载体pETDuet‐NB‐NA；之后将该硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株内，获得硝酸盐还原酶过表达重组菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括：

NA‐Nde I‐F:CCATATGGTGGACAGCTCGCCGGACCGCATC

NA‐EcoR V‐R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGTGCCGTGCTCCCCGTCG

NB‐Nco I‐F:ACCATGGTGACGTCCACGCACTGCCCCTACTGC

NB‐Hind III‐R:CCAAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGCGGGCGTACCGCCTCC。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸5min。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。

7.一种根据上述任一权利要求所述的硝酸盐还原酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于硝酸盐还原酶的体外高效表达，并最终实现硝酸盐还原酶的工业发酵生产。