[发明专利]用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒

说明书

本发明公开了一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC C2014128的杂交瘤细胞株PBP2α‑4B8‑G7‑H7所分泌的。本发明还公开了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，包被抗体为本发明所述的抗PBP2α单克隆抗体；检测抗体为HRP标记的抗PBP2α多克隆抗体。本发明所述的试剂盒能通过本发明所述的抗PBP2α单克隆抗体来检测样本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有简便、快捷、实用、灵敏、高效的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，以及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，可英国的Jevons就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。MRSA耐药性的产生与一种青霉素结合蛋白(PBP)有关。五种PBP(1，2，3，3′和4)，它们具有合成细菌细胞壁的功能。它们与β-内酰胺类抗生素有很高的亲和力，能共价结合于β-内酰胺类药物的活动位点上，失去其活性导致细菌死亡，而MRSA产生了一种独特的PBP，这种分子量增加了78～1000道尔顿的PBP，因其电泳率介于PBP2与PBP3之间，故称为PBP2α。PBP2α对β-内酰胺类抗生素亲和力很低，因而很少或不被β-内酰胺类药结合。在β-内酰胺类抗生素存在的情况下，细菌仍能生长，表现出耐药性。PBP2α的产生是受染色体甲氧西林耐药基因(mec A)来调节的。MRSA与MSSA根本区别在于它们的PBP不同。

MRSA的不均一耐药性，给其检测带来一定的困难。MRSA的检出率受孵育温度、时间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种因素的影响。因此，目前还没有一种最佳的检测方法。

MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素有多重耐药。因其耐药机制是PBPs(青霉素结合蛋白)性质的改变，因此，MRSA几乎对所有的β-内酰胺类抗生素耐药，且在同时，还可能对大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素等多种抗菌药物表现出耐药性。因此急需一种可抑制MRSA生长的非抗生素类药物。

目前检测MRSA的方法主要包括琼脂筛选法和PCR技术。

琼脂筛选法是1997年NCCLS推荐的MRSA的确证试验，即MH培养基加NaCl(40g/L)加苯唑西林(6μg/ml)，将菌液(0.5麦氏浊度)点种或画线35℃孵育24h，只要平皿有菌生长，即使一个菌落也是MRSA，该法敏感度为100％，常用作校正其它方法的标准，尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌。结果容易判断，但耗时，费力。

PCR法是指根据金黄色葡萄球菌的mec A基因DNA序列设计一引物，再裂解提取被测菌的DNA作为模板，在一定条件下进行扩增，经琼脂糖电泳后在紫外灯下观察有无与阳性对照菌株(金黄色葡萄球菌ATCC29213)相同的区带。PCR具有较高的灵敏度，只要被测菌有微量的基因，即出现阳性结果，因此常作为检测MRSA的参考方法。但PCR很灵敏，有时会因实验室的污染而出现假阳性，为使PCR具有更高的可靠性，必须对其扩增产物进行探针杂交或测序以提高特异性。而有一些耐药基因是沉默基因，不表达mec A基因产物，有时会出现假阴性，所以分子生物学方法并非100％的敏感和特异，加上该法前期处理操作繁琐，且需要一定的设备。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体。