[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞周期蛋白E基因序列，具体地说，是涉及一种斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列，本发明还涉及该斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，属于分子生物学中基因克隆领域。

背景技术

细胞周期蛋白E是细胞周期调控过程中一个非常重要的蛋白，主要在细胞G1期与CDK7结合并起作用，周期蛋白E属于G1期的正调节因子，主要对G1期到S期的过渡进行调控，与同作为G1/S转换点功能调控的因子CyclinD、抑癌基因视网膜神经胶质细胞瘤蛋白(retinob lastoma protein，Rb)、转录因子E2F、抑癌基因p53、KIP家族、CDK2、4、5等相互作用共同决定细胞周期的正常进行。周期蛋白E在进入S期后便立即被泛素化降解。

目前发现的Cyclin家族成员可分为10大类：A～J，包括亚型共15种，其中周期蛋白E是参与细胞周期G1/S期转换的重要正性调节因子且在人的研究中最为广泛，大多集中于周期蛋白E对肿瘤治疗方面。近些年来，各国对肿瘤的研究逐渐集中在细胞周期调控方面，而周期蛋白E与CDK2结合后的复合物在周期调控方面起着举足轻重的作用，特别是其涉及的G1期磷酸化作用，更是当前的研究热点。

随着基因克隆技术的发展，目前周期蛋白E基因在很多物种中相继被克隆出来，如Homo sapiens：人(AAM54043.1)；Danio rerio:斑马鱼(NP_001002075.1)；Megachile rotundata：切叶蜂(XP_003700054.1)；Carassius auratus:鲫鱼(BAA85846.1)等，但在对虾中研究较少。

目前斑节对虾的养殖过程存在雌性对虾性腺发育不同步，且人工催熟效果差的问题，而细胞周期调控的研究对探讨卵巢发育机理即雌虾性成熟问题具有相当重要的意义，所以，期望通过对周期蛋白E的研究为发现新的催熟方法提供一定的理论支持。

发明内容

针对上述问题，本发明的以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白E基因的全表达序列，有利于人工催熟斑节对虾。

为解决前一技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供的后一技术方案是这样的：该斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，依次包括下述方法：

1)总RNA的提取

对斑节对虾解剖并取出性腺混合液，将性腺混合液于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存；

2)cDNA第一链的合成

将步骤1)中的斑节对虾性腺总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链；

3)斑节对虾细胞周期蛋白E基因的PCR扩增、克隆

以步骤1)中合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增法对目的基因的5ˊ和3ˊ末端进行PCR扩增；

其中：

在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接头引物和cycE-F1、cycE-F2进行PCR扩增；

在5ˊRACE中，首先利用末端转移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA为模板，以cycE-R1和oligo-dG为引物进行一次PCR，所得PCR产物取用cycE-R2和oligo-dG进行二次PCR扩增；

4)对斑节对虾细胞周期蛋白E基因的测定

所得到的PCR产物在分离检测后，再将PCR产物纯化，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，测序；

5)斑节对虾细胞周期蛋白E的分布和表达

a)提取斑节对虾不同组织的RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法，在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析；

b)依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit试剂盒说明书进行PCR反应，再采用相对ΔCT法分析Pmcyclin E基因在各样品中的相对表达量；

c)分别提取实验室保存的经过MIH处理及眼柄切除手术的卵巢RNA，然后按照上述a)所示方法进行反转录及荧光定量。