[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.制备权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的方法，其特征在于，依次包括下述方法：

1)总RNA的提取

对斑节对虾解剖并取出性腺混合液，将性腺混合液于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存；

2)cDNA第一链的合成

将步骤1)中的斑节对虾性腺总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链；

3)斑节对虾细胞周期蛋白E基因的PCR扩增、克隆

以步骤1)中合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增法对目的基因的5ˊ和3ˊ末端进行PCR扩增；

其中：

在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接头引物和cycE-F1、cycE-F2进行PCR扩增；

在5ˊRACE中，首先利用末端转移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA为模板，以cycE-R1和oligo-dG为引物进行一次PCR，所得PCR产物取用cycE-R2和oligo-dG进行二次PCR扩增；

4)对斑节对虾细胞周期蛋白E基因的测定

所得到的PCR产物在分离检测后，再将PCR产物纯化，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，测序；

5)斑节对虾细胞周期蛋白E的分布和表达

a)提取斑节对虾不同组织的RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR Green Ⅰ染料法，在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析；

b)依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit试剂盒说明书进行PCR反应，再采用相对ΔCT法分析Pmcyclin E基因在各样品中的相对表达量；

c)分别提取实验室保存的经过MIH处理及眼柄切除手术的卵巢RNA，然后按照上述a)所示方法进行反转录及荧光定量。

3.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反转录引物的序列为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3。

4.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反转录酶为M-MLV。

5.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反应条件：42℃60min，70℃15min。

6.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的cycE-F1：5>ACGCCAACCTGACTACCT<3；

cycE-F2：5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3；

cycE-R1：5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3；

cycE-R2：5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC<3。

7.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的3ˊRACE中反应条件：94℃，5min；94℃，45s；60℃，30s；72℃，45s；35cycles；72℃，10min。

8.根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的在5ˊRACE中反应条件：94℃，5min；94℃，45s；61℃，30s；72℃，45s；35cycles；72℃，10min。