[发明专利]一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及玉米组织培养技术领域，具体涉及一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法。

背景技术

玉米是一种重要的单子叶模型植物，广泛应用于基因组学、分子生物学、遗传学等研究。玉米幼胚所诱导的愈伤在遗传转化、研究植物生长发育规律、种质快繁、种质改良等方面具有重要意义。目前，玉米幼胚诱导愈伤过程中主要使用的培养基配置程序繁琐、继代时间间隔短、耗费人工、存在愈伤畸形率及褐化率高等问题，限制了幼胚诱导愈伤的应用。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种玉米幼胚高效诱导继代培养基及制备方法，具有简便易行、操作简便、提高愈伤诱导率等优点。

为实现上述目的，本发明提供一种玉米幼胚高效诱导继代培养基，由包括维生素母液1000*1.5mL、诱导愈伤培养基1L和硝酸银溶液100μL制备而成。

所述诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成：N6培养基粉末3.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.002-0.004g/L，脯氨酸2.5-3.5g/L，酪蛋白水解物0.1-0.2g/L，肌醇0.1-0.3g/L，蔗糖30-40g/L，吗啉乙磺酸(MES)0.5g/L。

优选的，所述诱导愈伤培养基由包括下述组分的原料制备而成：N6培养基粉末3.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.003g/L，脯氨酸2.8g/L，酪蛋白水解物0.2g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖35g/L，吗啉乙磺酸0.5g/L。

优选的，所述维生素母液由包括下述组分的原料制备而成：维生素B10.6g/L、维生素B60.6g/L、烟酸0.5g/L，泛酸0.5g/L。

优选的，所述硝酸银溶液的浓度为50mM。

本发明还提供了上述培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)将维生素母液、硝酸银溶液灭菌，-20℃保存备用；

2)将诱导愈伤培养基原料溶解，定容至1L，调PH值至5.8，加入植物凝胶，将诱导愈伤培养基进行高温灭菌；

3)诱导愈伤培养基冷却至50℃时，加入维生素母液、硝酸银溶液，制得诱导继代培养基。

优选的，所述步骤2)中植物凝胶的加入量为2-4g/L。

优选的，步骤1)中所述灭菌为抽滤灭菌或高温灭菌。

进一步地，步骤1)中所述灭菌为抽滤灭菌。

优选的，步骤2)中所述高温灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。

优选的，步骤3)制得诱导继代培养基分装入90mm无菌培养皿中，50皿，密封，4-20℃保存，培养基效期为60天。

本发明还提供了上述制备方法制得的培养基应用于玉米愈伤组织的诱导和继代培养。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1)本发明额外配置维生素母液，抽滤灭菌，在培养基灭菌后，冷却至50℃添加，充分保持了维生素的活性，保证了维生素的抗氧化性及愈伤的营养供应。有别于现有技术添加维生素粉末，经过高温灭菌，活性丧失。特别添加酪蛋白水解物促进愈伤生长。

2)本发明中从诱导愈伤到愈伤的持续继代培养，都只使用了一种培养基，有别于现有技术中首先使用诱导愈伤培养基(诱导幼胚生成愈伤)，两周后使用继代培养基(持续培养愈伤)。因此，便于操作，节约成本。

3)本发明中得到的愈伤褐化率低于现有技术的50％，且畸形愈伤不足1％，在现有技术中畸形愈伤率为5％。

4)本发明得到的愈伤繁殖率高，为97％以上，高于现有技术的60％以上。

5)本发明愈伤诱导率高、生长速度快、培养基效期长，适用于商业化玉米愈伤诱导。

附图说明

图1为实施例1中诱导出的玉米HiⅡ愈伤。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

试验开始10天后，根据幼胚是否膨大，判定愈伤诱导率。

试验开始45天后(此时受体材料继代一次以上，愈伤状态有明显差异)，根据愈伤状态，判定畸形率及褐化率。

愈伤状态：

Ⅰ型：白色，结构致密，坚硬，干燥，表面皱起，生长速度缓慢，易发生器官分化，不能长期继代；

Ⅱ型：乳白色，结构松散，较湿润，可以长期继代；

Ⅲ型：黄褐色，水浸状，生长慢的愈伤，不能长期继代。

公式：

愈伤诱导率＝膨大的幼胚数/幼胚总数；

畸形率＝Ⅰ型愈伤数/愈伤总数；

褐化率＝Ⅲ型愈伤数/愈伤总数。