[发明专利]检测甲基对硫磷的化学发光免疫检测试剂盒的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测甲基对硫磷(MP)的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测水果、蔬菜、农作物等中的甲基对硫磷(MP)含量或残留量。属于免疫学检测领域。

背景技术

甲基对硫磷（Parathionmethyl）也叫O,O-二甲基-O-对硝基苯硫代磷酸酯，是一种产量大、应用广的高毒有机磷酸酯类杀虫剂，由于其毒性较高，近年来已在蔬菜水果上禁止使用。但在蔬菜生产中仍存在农药乱用、滥用的现象，在农产品的进出口贸易、食品安全的监督检测中，甲基对硫磷（MP）仍然是常规检测的重点。

甲基对硫磷（MP）残留分析一般使用气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）及气相色谱质谱联用技术（GC/MS），这些方法灵敏、准确，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器，样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高，而且需专业人员操作，很难满足对样品进行现场、批量、快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于农药残留现场监控的分析方法具有重要的现实意义。

化学发光免疫检测技术是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。本发明通过特有的免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的甲基对硫磷抗体，并采用酶标记抗体，建立一种可以检测甲基对硫磷的化学发光免疫试剂盒，将为水果、蔬菜、农作物等中甲基对硫磷药物留检测提供新方法，本方法具有操作简便、快捷，灵敏度高、特异性好等特点。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中甲基对硫磷含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中甲基对硫磷含量越少，发光强度越高。

本发明是一种检测甲基对硫磷(MP)的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下成份：

1、包被有甲基对硫磷-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板；所述甲基对硫磷-载体蛋白偶联物是将甲基对硫磷与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到，所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白；

2、甲基对硫磷标准品；

3、甲基对硫磷-过氧化物酶标记抗体：该成分为用过氧化物酶标记的甲基对硫磷抗体，所述甲基对硫磷抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

4、发光底物液：该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液，分为A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液位发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺，B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液；

5、2倍浓缩稀释液；

6、20倍浓缩洗涤液。

本发明中，所述的不透明白色酶标板为96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。

本发明中，所述的甲基对硫磷(MP)标准品，由一系列不同浓度的甲基对硫磷(MP)标准品组成，浓度为0.01~25ng/mL的浓度区间。

本发明中，所述的甲基对硫磷-过氧化物酶标记抗体为用过氧化物酶标记的甲基对硫磷抗体，如辣根过氧化物酶(HRP)标记的甲基对硫磷抗体。

本发明中，所述的发光底物液为商品化的任一种以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液。

本发明中，所述所述2倍浓缩稀释液，其成分为0.01mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液，使用前请按1：1稀释（1份浓缩样品稀释液+1份去离子水）。

本发明中，所述20倍浓缩洗涤液，其包含0.05%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间，使用前请按1：19稀释（1份浓缩稀释液+19份去离子水）。

本发明的甲基对硫磷(MP)的化学发光免疫检测试剂盒应用于甲基对硫磷的检测时，检测步骤为：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，氮气吹干并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被甲基对硫磷抗原的酶标板，加标准品/待测样品50μL/孔到对应的微孔中,标准品和样品每个浓度做两个平行实验；

(4)加入甲基对硫磷抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min；