[发明专利]引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗

说明书

技术领域

   本发明涉及微生物领域，特别是一种引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的转化减毒李斯特菌及其疫苗。

背景技术

   肿瘤及其相关性疾病对人们的健康产生了越来越多的威胁。目前，据统计全世界鼻咽癌有80%发生在我国，是我国南方多发的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中居第五位。鼻咽癌好发于解剖结构复杂的咽隐窝，肿瘤生长隐蔽，以早期淋巴结转移为特征，其侵袭性强、复发率高等特点给临床治疗带来很大的难度。

   研究表明EB病毒（Epstein-barr virus, EBV）的感染与鼻咽癌的发生具有密切关系，EBV潜伏基因产物在致瘤中发挥重要作用，其中潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A, LMP2A）是能在静止B细胞中唯一可检测到的EBV潜伏基因表达产物，研究已经证实在非角化鼻咽癌约有大于95%的患者表达LMP2A，但其对肿瘤演进的机制目前不是十分清，由于LMP2A受人类白细胞抗原限制的抗原决定簇较多且序列相对保守，无致癌潜能，因此在鼻咽癌的免疫治疗中扮有十分重要的作用，是非常理想的疫苗靶标。

   李斯特菌（Listeria monocytogenes)是一种格兰染色阳性的胞内寄生菌，对体抗力较差的老人、孕妇和小孩能够引起腹泻，20世纪，李斯特菌被认为是最有潜力的活疫苗载体，目前全球十大最有潜力的疫苗中，李斯特菌疫苗独占两席，李斯特菌在体内主要被巨噬细胞、肝库普佛细胞及脾淋巴细胞吞噬。李斯特菌溶血素O能够溶解细胞膜，使得李斯特菌能够自由进出细胞，在细胞与细胞之间传播，李斯特菌在胞内期分泌的蛋白可被蛋白酶降解并递呈给MHC-I 类通路，同时，该分泌蛋白可以直接被递呈并激活MHC-II分子通路；因此，李斯特菌疫苗可以激活CD4+和CD8+的T淋巴细胞，具有很强的激发细胞免疫应答的能力。

  申请号为“201310598574.9”的中国专利，公布一种利用PKSV7穿梭质粒引入人源CD24核苷酸序列的转化减毒李斯特菌疫苗，用以表达人CD24蛋白，但是通过分子克隆技术使李斯特菌表达及分泌EB病毒LMP2A蛋白，激活机体免疫应答，产生相应抗体，但是它不适于治疗及预防鼻咽癌，如何将减毒李斯特菌用于治疗及预防鼻咽癌的技术目前未见有报道。

发明内容

    为克服现有技术中鼻咽癌治疗的诸多不足，提供一种治疗鼻咽癌，特别是能够预防鼻咽癌的发生且具有较高安全性的转化减毒李斯特菌疫苗。

本发明的技术方案是：

   一种引入EB病毒LMP2A核苷酸序列转化的减毒李斯特菌或其子代，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于p1565穿梭质粒上，并在减毒李斯特菌或其子代中复制并表达；所述p1565穿梭质粒含有编码枯草芽孢杆菌的右旋-丙氨酸合成酶基因序列，为减毒李斯特菌存活所必须。

  本发明中，转化减毒李斯特菌的方法，包括引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的步骤，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于p1565穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达，所述p1565穿梭质粒含有编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸合成酶的基因序列。

  本发明中，一种包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，包括引入EB病毒LMP2A核苷酸序列的步骤，所述EB病毒LMP2A核苷酸位于P1565穿梭质粒上，并于减毒李斯特菌或其子代中复制并表达，所述p1565穿梭质粒含有编码减毒李斯特菌存活必须的右旋-丙氨酸合成酶的基因序列。

  本发明中，所述的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗，其特征在于：将减毒李斯特菌菌体通过氯霉素抗性筛选，在无抗性的BHI培养基中，优选得到稳定的无氯霉素抗性的减毒李斯特菌疫苗。

  本发明提供的转化的减毒李斯特菌能够过表达及分泌EB病毒LMP2A蛋白，有效的激活机体免疫系统，产生特异性抗体和有效的细胞免疫应答，杀伤鼻咽癌细胞，具有很好的防治肿瘤的作用。

 本发明提供的包含转化的减毒李斯特菌或其子代的疫苗和现有技术相比具有以下优点：

    1、静脉注射本发明提供的减毒李斯特菌疫苗具有较高的安全性和可靠性，对各种组织器官无明显的损伤作用。