[发明专利]基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于电化学免疫分析技术领域，特别是传感器的制备技术。

背景技术

结核病是对奶牛健康和产乳品质影响最为严重的传染疾病之一。牛伽马干扰素（BoIFN-γ）是在特定诱生剂刺激作用下，由T细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早、关注最多的细胞因子。

目前，牛伽马干扰素的检测常用生物学分析方法，这些生物学分析方法灵敏度低，费力、耗时、且难于标准化。另外，它们对检测样品中的缓冲剂和其它细胞因子敏感，容易受到干扰。虽酶联免疫吸附分析也被建立来检测牛伽马干扰素，但是这些方法同样操作繁琐，费力、耗时，并且灵敏度也不能令人满意。

由于牛伽马干扰素分子量较小，且在机体体液中的量极少，目前测定牛伽马干扰素的方法灵敏度距离临床实际应用还有较大差距。因此，当前急需建立一种超高灵敏度、快速、可靠的方法检测牛伽马干扰素，为牛结核病的早期诊断提供一个平台。

近年来，电化学阻抗免疫分析法由于其无需标记，灵敏度高，特异性好，样品消耗量小、简单快速等特点，成为一种极有竞争力的现场检测方法。

氧化锌纳米材料是具有独特化学、生物、物理和机械性能的纳米材料，为电化学免疫分析研究提供了新研究途径。

发明内容

本发明的第一个目的是提出能克服上述牛伽马干扰素检测方法的缺陷，构建一个基于不同形貌氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素电化学阻抗免疫传感器。

本发明的技术方案是：将氧化锌纳米材料修饰玻碳电极后，再在电极上固定牛伽马干扰素抗体，即得到电化学阻抗免疫传感器。

本发明采用不同形貌、性能优良的氧化锌纳米材料，比如棒状氧化锌、颗粒状氧化锌及管状氧化锌纳米材料等，氧化锌纳米材料具有比表面积大，生物相容性好等优点，利用其固定牛伽马干扰素抗体，有利于保持抗体的生物活性，拓宽检测的线性范围，提高免疫应特异性和反应效率，减少非特异性吸附，提高检测灵敏度。本发明利用其固定牛伽马干扰素抗体，实现对牛伽马干扰素的定量检测。

具体的制备方法包括以下步骤：

1）将氧化锌纳米材料分散于去离子水中，形成含有氧化锌的混合剂；

2）将含有氧化锌的混合剂均匀地涂覆于洁净的玻碳电极表面，经晾干后，再于玻碳电极表面均匀地涂覆牛伽马干扰素抗体，然后置于4 ℃的温度环境下干燥后，再于玻碳电极表面均匀地修饰一层萘酚膜，最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点。

通过以上工艺，可将材料和抗体牢牢固定在电极上，制得用于检测牛伽马干扰素的电化学阻抗免疫传感器。将制得的免疫传感器置于检测体系中，加入牛伽马干扰素抗原，经温育、冲洗后检测其电化学阻抗信号。以本方法制备的传感器进行测试的方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。

另外，为了提高检测的准确性，本发明还在涂覆含有氧化锌的混合剂前，将玻碳电极先用粒径为0.05 mm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，以此取得表面洁净的玻碳电极。

另外，本发明还提出另一发明目的：以上发明方法制得的电化学阻抗免疫传感器在牛伽马干扰素检测中的应用。

其技术方案是：在以含有5.0 mM 的[Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1 M KCl的0.1 M 、pH值为7.0的PBS溶液为测试液中，以制得的电化学阻抗免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，加入牛伽马干扰素抗原，经37.5℃温育40 min后，取出工作电极冲洗，然后检测工作电极的电化学阻抗信号。

由于本发明对缓冲溶液的pH、温育温度和温育时间进行了优化，并获得了最佳的牛伽马干扰素检测条件，提高了分析效果。该方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。

因此，本发明利用氧化锌纳米材料固定牛伽马干扰素抗体，构建一个无标记电化学阻抗免疫传感器实现对牛伽马干扰素的定量检测，对牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究具有重要意义。

附图说明

图1为牛伽马干扰素免疫传感器制备原理图及无标记阻抗免疫分析示意图。

图2为本发明方法制备的BoIFN-γ免疫传感器的线性拟合图。

具体实施方式

实施例1：