[发明专利]以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。

背景技术

香樟(Cinnamomum camphoraL.)，樟科樟属植物，是亚热带常绿阔叶林的代表树种。其树形优美，枝繁叶茂，绿荫蔽日，气势雄伟，是优良的城市园林绿化常用树种。在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，随着城市建设发展及园林绿化的新要求，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，不少园林工作者都在尝试引种此树，香樟被广泛引种栽植到黄河流域的一些省分，用以丰富当地绿化树种。

北方漫长而寒冷冬季往往会导致香樟正常生长受损，严重时树体甚至死亡，从而造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在北方城市顺利推广及应用的一个重要问题。解决这一问题的主要方法是加强栽培管理和选育抗冻新品种，而后者是根本途径。采用生物技术方法，通过转基因手段进行分子育种，是一种“定向育种”，可有效缩短育种周期。生物技术改良香樟必须以高效植株再生体系的建立为研究基础，但目前由于采用香樟胚性愈伤组织为转基因外植体材料，存在转基因胚性愈伤组织再生困难，从而难获转基因植株等问题，制约着生物技术改良香樟的进程。

目前，在转基因技术改良香樟育种中，外植体大多采用的是香樟胚性愈伤组织，胚性愈伤组织对香樟这个物种而言再生频率较低；转化外源基因后，在选择阳性转化材料时，选择配方中一定浓度的抗生素更增加诱导转基因胚性愈伤组织再生植株难度。两种不利因素叠加导致选用香樟胚性愈伤组织做为外植体进行遗传转化很难获得转基因再生植株。

南阳师范学院的专利申请“香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法”(受理号：201410188756.3)，提出以香樟子叶胚培养苗茎切段为外植体，通过直接器官发生途径，建立高频植株再生体系的方法，因其不具有具体遗传转化步骤，因此无法实现香樟品种改良。

目前，国内外没有关于香樟通过器官发生途径获得转基因植株的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。

本发明所采用的技术方案是，一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包含下列步骤：

步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；

步骤2、将步骤1中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化；

步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；

步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。

本发明的特点还在于，

不定芽诱导配方S1为：MS+30g/L蔗糖+0.8％琼脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D，pH6.0。

步骤1中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方S1中增殖生长2w的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有1节，长为5～7mm。

预培养条件是：预培养时间为2d，其培养条件均为光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～3000Lx，培养温度为22℃-26℃。

农杆菌侵染液的菌液浓度为OD₆₀₀＝0.4～1.0；侵染时间为20～50min。

步骤3中的共培养条件为：共培养时间为3d，共培养培养基为不定芽诱导配方S1；共培养条件暗培养，培养温度为28℃。

步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为：含抑菌剂头孢霉素cef和筛选剂潮霉素hyg的不定芽诱导培养基S1，即：S1+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。

步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施：将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～3000Lx，培养温度为22℃-26℃，选择培养2w后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2w后筛选即得到阳性抗性芽。