[发明专利]以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法

权利要求书

1.一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，包含下列步骤：

步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；

步骤2、将步骤1中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化；

步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；

步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。

2.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述不定芽诱导配方S1为：MS+30g/L蔗糖+0.8％琼脂粉+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D，pH6.0。

3.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤1中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方S1中增殖生长2w的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有1节，长为5～7mm。

4.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述预培养条件是：预培养时间为2d，其培养条件均为光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～3000Lx，培养温度为22℃-26℃。

5.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的菌液浓度为OD₆₀₀＝0.4～1.0；侵染时间为20～50min。

6.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤3中的共培养条件为：共培养时间为3d，共培养培养基为不定芽诱导配方S1；共培养条件暗培养，培养温度为28℃。

7.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为：含抑菌剂头孢霉素cef和筛选剂潮霉素hyg的不定芽诱导培养基S1，即：S1+cef300mg/L+hyg25mg/L或35mg/L。

8.根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施：将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000～3000Lx，培养温度为22℃-26℃，选择培养2w后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2w后筛选即得到阳性抗性芽。