[发明专利]植物病毒表达载体及其用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途

权利要求书

1. 植物病毒表达载体，其包含pTRV骨架和编码异源多肽的核酸序列，所述核酸序列缺乏如SEQ ID NO: 43所示的2b序列。

2. 权利要求1的植物病毒表达载体，其中所述异源多肽包含兆碱基大范围核酸酶。

3. 权利要求1的植物病毒表达载体，其中所述异源多肽包含嵌合核酸酶。

4. 权利要求2的植物病毒表达载体，其中所述嵌合核酸酶包含DNA结合结构域和核酸酶。

5. 权利要求4的植物病毒表达载体，其中所述核酸酶选自限制性酶、拓扑异构酶、重组酶、整合酶和DNA酶。

6. 权利要求4的植物病毒表达载体，其中所述核酸酶包含II型限制性内切核酸酶的切割结构域。

7. 权利要求4的植物病毒表达载体，其中所述核酸酶选自FokI、I-SceI、I-CeuI、归巢核酸酶、DNA促旋酶、真核拓扑异构酶II、细菌拓扑异构酶IV、拓扑异构酶VI、Cre重组酶、Hin重组酶、Rad51/ RecA、脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II和微球菌核酸酶。

8. 权利要求4的植物病毒表达载体，其中所述DNA结合结构域选自螺旋-转角-螺旋(pfam 01381)、亮氨酸拉链(ZIP)结构域、翼状螺旋(WH)结构域、翼状螺旋转角螺旋结构域(wHTH)、螺旋-环-螺旋和锌指结构域。

9. 权利要求4的植物病毒表达载体，其中所述嵌合核酸酶进一步包含定位至含DNA细胞器的定位信号。

10. 权利要求2的植物病毒表达载体，其中所述兆碱基大范围核酸酶进一步包含定位至含DNA细胞器的定位信号。

11. 权利要求1的植物病毒表达载体，其中所述核酸序列编码两种异源多肽。

12. 权利要求1的植物病毒表达载体，其中所述pTRV为pTRV2。

13. 权利要求11的植物病毒表达载体，其中所述核酸序列包含两个分离的亚基因组启动子(sgP)，用于调节所述两种异源多肽的转录。

14. 权利要求11的植物病毒表达载体，其中所述两种异源多肽由编码切割结构域的核酸序列分离开。

15. 权利要求14的植物病毒表达载体，其中所述切割结构域包含如SEQ ID NO: 40所示的T2A-样蛋白序列。

16. 产生植物的方法，所述方法包括将至少一种权利要求1-15中任一项的植物病毒表达载体引入所述植物的一个或多个细胞中。

17. 在植物基因组中产生遗传型变异的方法，所述方法包括将至少一种权利要求4-9中任一项的植物病毒表达载体引入所述植物中，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此在植物基因组中产生遗传型变异。

18. 权利要求17的方法，其进一步包括将DNA载体引入所述植物中。

19. 治疗病原体的植物感染的方法，所述方法包括将至少一种权利要求4-9中任一项的植物病毒表达载体引入所述植物中，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶特异性地靶向病原体基因组，由此预防或治疗病原体的植物感染。

20. 标记植物基因组的方法，所述方法包括将至少一种权利要求4-9中任一项的植物病毒表达载体引入所述植物中，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此标记植物基因组。

21. 在植物中产生雄性不育的方法，所述方法包括在所述植物中上调与雄性不育相关的线粒体或叶绿体结构或功能基因，其通过将至少一种权利要求9的植物病毒表达载体和包含至少一种当靶向至所述线粒体或叶绿体基因组时能上调线粒体或叶绿体所述结构或功能基因的异源核酸序列的核酸表达构建物引入植物中，其中所述定位至含DNA细胞器的定位信号包含线粒体或叶绿体定位信号，由此在植物中产生雄性不育。

22. 产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括将至少一种权利要求4-9中任一项的植物病毒表达载体引入所述植物中，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶靶向赋予对除草剂敏感性的基因，由此产生除草剂抗性植物。

23. 权利要求16-22中任一项的方法，其中所述的植物选自矮牵牛(Petunia hybrida)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、青蒿(Artemisia annua)、甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)、Solanum pimpinellifolium、番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)、菠菜(Spinacia oleracea)、豌豆(Pisum sativum)、甜椒(Capsicum annuum)、黄瓜(Cucumis sativus)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、陆地棉(Gossypium hirsutum) cv. Siv’on、稻(Oryza sativa)和 Oryza glaberrima。