[发明专利]用于检测25-羟基维生素D的检测剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物免疫学检测领域，具体涉及一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂及其制备方法和应用。

背景技术

维生素D是一种脂溶性维生素。人体中的维生素D仅有小部分来源于食物(＜10％)，体内所需的维生素D的90％来源于阳光中紫外线照射皮肤产生。维生素D在体内出现的主要形式是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D2的营养来源主要是一些蔬菜、酵母和真菌类食物，维生素D3是由皮下的7-脱氢胆固醇在阳光的作用下转化而成。

食物源和自身合成的维生素D2和维生素D3经血液循环进入肝脏，在25-羟化酶作用下分别转化为25-OH维生素D2和25-OH维生素D3，总称为25-OH维生素D。血清或血浆中25-OH维生素D的含量能反映事物摄入和自身合成的维生素D总量，因此25-OH维生素D是衡量维生素D营养状态的最佳指标。

25-羟基维生素D是人体内存储维生素D的主要形式，是人体内代谢活动不可缺少的营养物质。除了具有传统意义上的骨骼效应，还具有影响自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、肿瘤等非骨骼效应。研究发现，维生素D缺乏会直接影响人类基因的表达，这些基因与风湿性关节炎和糖尿病等众多疾病有关。

目前，临床上对维生素D的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。建立一种快速，简便，灵敏，准确可靠的检测维生素D水平的方法尤为重要。25-羟基维生素D的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，由于存在仪器昂贵、样本前处理复杂、过程繁琐费时等缺陷，该方法的应用受到限制。免疫学方法具有灵敏、快速、特异和简便等优势，现在成为维生素D测定的主流方法。在目前的市场上，用于测定25-羟基维生素D的主流产品是意大利Diasorin公司生产的检测试剂盒，检测方法是采用标记ABEI(N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺)的25-羟基维生素D抗原衍生物和样本中的抗原与包被于磁性微球上的25-羟基维生素D抗体竞争结合，然后加入激发底物产生发光信号，从而实现25-羟基维生素D的定量检测，图1更形象地展示了其操作原理(具体操作步骤及实验条件可参考其DiaSorin-VD说明书)。在检测过程中，标记ABEI的25-羟基维生素D抗原衍生物的稳定性是影响检测稳定性的最主要的因素，而25-羟基维生素D抗原衍生物是一种稳定性差，遇光、遇热等都会导致活性下降的物质，因此上述检测试剂盒中的试剂稳定性差，活性易下降。

因此，免疫学竞争法测定所采用的25-羟基维生素D抗原衍生物的不稳定性导致了25-羟基维生素D免疫学方法测定试剂不能长期稳定地保存，从而影响其使用和检测结果，且保存条件苛刻，不方便储存和运输，这成为目前此类方法大规模商品化应用的瓶颈。

发明内容

针对以上缺陷，本发明提供一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂，其是将25-羟基维生素D抗原衍生物偶联至载体蛋白后固定到磁性微球上，通过固定至磁性微球使得抗原衍生物的稳定性得到显著提高，同时该衍生物的特定结构使得25-羟基维生素D的测定更加准确。

本发明还提供了上述用于检测25-羟基维生素D的检测剂的制备方法以及采用上述检测剂对25-羟基维生素D进行免疫学检测的方法，还提供了包含所述25-羟基维生素D检测剂的试剂盒。

根据本发明，提供了一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂，其包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物，以及被所述偶联物包被的磁球。

在现有技术中，用于检测25-羟基维生素D的25-羟基维生素D抗原衍生物被发光标记物标记，而25-羟基维生素D抗体则包被磁球，其作用原理如图1所示。然而，该产品存在稳定性较差的缺点。因为25-羟基维生素D抗原衍生物具有光敏性，且容易被氧化，用发光标记物标记25-羟基维生素D抗原衍生物的过程中容易造成其部分失活，而且发光标记物标记的25-羟基维生素D抗原衍生物在溶液中的长期稳定性不好，容易造成活性下降。因此，用于检测25-羟基维生素D的这类检测剂的保存条件较为苛刻，稳定性较差，从而造成使用期限较短、使用效果较差。

本发明将25-羟基维生素D抗原衍生物包被在固相载体磁球上，一方面减少了25-羟基维生素D抗原衍生物分子的自由度，另一方面磁球的颜色屏蔽了部分光照对25-羟基维生素D抗原衍生物分子的影响，因此大大增强了25-羟基维生素D抗原衍生物在溶液中的稳定性，从而可以延长其有效使用期限以及提高测定结果的准确性。