[发明专利]用于检测25-羟基维生素D的检测剂及制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测25-羟基维生素D的检测剂，其包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物，以及被所述偶联物包被的磁球。

2.根据权利要求1所述的检测剂，其特征在于，所述25-羟基维生素D抗原衍生物的结构式为：

其中，m为0、1、2或3，n为2、3、4、5或6。

3.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述蛋白载体选自牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛γ球蛋白和人γ球蛋白中的任一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述磁球表面带有环氧基、磺酰基、羧基、氨基、醛基、酰胺基、巯基和羟基中的一种或多种基团。

5.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述磁球的粒径大小为0.8-3.0μm。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述的用于检测25-羟基维生素D的检测剂的制备方法，包括使用所述25-羟基维生素D抗原衍生物和蛋白载体形成的偶联物包被磁球。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在包被磁球之前，使用第一活化剂将磁球进行活化处理，并将经所述活化处理后的磁球分散于缓冲液中，并加入25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物进行反应，经固液分离，清洗固体，得到所述检测剂；

其中，所述第一活化剂为N，N-二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的至少一种或其与N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐中的至少一种的混合物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物的制备步骤，所述制备步骤包括使所述25-羟基维生素D抗原衍生物和所述蛋白载体在偶联剂和溶剂的存在下进行偶联反应生成所述偶联物；

其中，所述偶联剂选自戊二醛、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯中的至少一种；和/或所述溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、氯仿中的至少一种。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物的制备步骤，所述制备步骤包括：

m)使25-羟基维生素D抗原衍生物带有羧基，并使用第二活化剂进行活化；

n)将活化后的25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体在溶剂的存在下进行偶联，经分离得到所述偶联物；

其中，所述第二活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐中的至少一种和N，N-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的至少一种的混合物；和/或所述溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、氯仿中的至少一种。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述25-羟基维生素D抗原衍生物与蛋白载体的摩尔比为10-20:1。

11.一种用于检测25-羟基维生素D的免疫学方法，包括使结合标记物的25-羟基维生素D抗体和如权利要求1-5中任一项所述的检测剂与待测样本中的25-羟基维生素D竞争结合。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述标记物选自荧光标记物、发光标记物、生物素标记物、金标记物或酶标记物。

13.一种用于检测25-羟基维生素D的发光免疫学方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)将待测样本与发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体进行温育；

b)向步骤a)的混合物中加入如权利要求1-5中任一项所述的检测剂，使所述发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体与所述检测剂和待测样本中的25-羟基维生素D竞争结合；

c)磁分离，得到发光标记物标记的25-羟基维生素D抗体与所述检测剂的结合物；

d)向步骤c)得到的结合物中加入激发底物，使其产生发光信号；

e)根据步骤d)测定的发光信号强度计算待测样本中的25-羟基维生素D含量。