[发明专利]一种易固定化肝素酶I编码基因及其蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及酶的基因工程改造，特别涉及到易固定化肝素酶I编码基因及其蛋白。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又发现在一些微生物和动物组织中也有肝素酶存在。肝素酶具有清除血液中残存肝素、防止凝血等功能，同时对生产低分子肝素、研究肝素的结构有重要的作用。然而游离的肝素酶容易失活，尤其是肝素酶I溶液在保存96h后活性只有原来的23%，此外，游离的肝素酶在发生反应时需要将其加入底物中，反应以后酶溶液、底物和产物混合在一起不容易分离，导致肝素酶无法重复使用，酶的利用效率低下，这为肝素酶的应用带来很多不便，因此，需要寻找一种既能提高肝素酶的利用效率，又能延长酶的保存时间的方法。

与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等一系列优点，因此，对肝素酶I的固定化是一种提高使用效果的理想选择。目前对肝素酶I进行固定化的研究较少，Howard Bernstein等[Bernstein, H. , (1987), Appl.Biochem. Biotech. 16, 129-143]以CNBr-activated Sepharose 4B为固定化材料，对肝素酶I进行了共价交联法的固定化，实现了肝素酶的固定，但是该方法的固定化效率低，我们采用相同的材料和方法得到的结果只能达到每毫升材料固定1IU的肝素酶I，而且以CNBr-activated Sepharose 4B为固定化材料成本较高。

经过长期研究，本发明的发明人首次通过在肝素酶I的基因C端加上几丁质结合域后转入工程菌中表达的方法，得到一种新型的易于固定化的肝素酶I，为实现高效且低成本的肝素酶I的固定化成为可能。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种易固定化肝素酶Ⅰ基因以及表达蛋白。

    本发明所提供的肝素酶Ⅰ蛋白，名称为HepA-1-chBD，其肝素酶HepA-1-chBD是具有序列表中SEQ IDNo:2氨基酸残基序列的蛋白质。

    序列表中的SEQ ID No:2由个801个氨基酸残基组成。

    固定化肝素酶Ⅰ蛋白编码基因，名称为HepA-1，其具有下列核苷酸序列之一：

    1)序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列：

    2)编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；

序列1中的DNA序列由个2043个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5’端第1到第2043位碱基。

扩增该蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种表达固定化肝素酶Ⅰ蛋白的方法。

本发明所提供的表达易固定化肝素酶Ⅰ蛋白的方法，是将含有上述肝素酶Ⅰ蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达肝素酶Ⅰ蛋白，且其带有MBP标签。

其中，所述易固定化肝素酶Ⅰ编码基因全序列是以构建好的PMAL-C2X-HepA为模板，以5 GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 3 和5 GGTCAGGCCAAGTTTtctggcagtttcgctgt 3 按照常规PCR方法得到,紧接着几丁质结合区域以人工合成的几丁质结合域为模板,以5 CAGCGAAACTGCCAGAAAACTTGGCCTGACCGGT和5 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3,按照常规PCR方法得到后,以上述两个PCR产物混合物为模板,以GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag和GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3为引物进行PCR后得到。所述宿主菌可为大肠杆菌，所述大肠杆菌可为以下菌株：BL21。

易固定化肝素酶Ⅰ蛋白的诱导表达条件可为0. 1mM IPTG .16摄氏度诱导20小时：所采用的培养基为LB培养基,胰蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L。

附图说明

图1为HepA-1的PCR电泳图谱。

图2为阳性转化子的双酶切鉴定示意图。

图3为HepA-1-chBD蛋白通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。

实施例1、缺失肝素酶Ⅰ蛋白HepA-1的表达。