[发明专利]一种工程菌及制备（3R, 5S）6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种工程菌及利用该工程菌制备(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法。

背景技术

他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性酶抑制剂药物，也是主要的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3，5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，可抑制体内胆固醇的合成，从而降低细胞游离胆固醇水平，反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R，5S/R)-双羟基己酸酯组成。其中，治疗心脑血管疾病的药物阿托伐他汀就是他汀类药物中的一种，而(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯则是阿托伐他汀的关键中间体。

目前，在医药工业生产中，制备(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法很多，主要分为化学法和生物酶法。其中，在已公开的(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的化学制备工艺中，普遍需要采用价格昂贵并对环境污染严重的催化剂和极端反应条件才能进行，例如采用-70℃的低温条件，并与易燃的硼烷类化合物反应等(Angew.Chem.Int.Ed.2000，39：4306-4307)。

相对而言，生物酶法的反应条件更加温和环保。例如美国专利US2008/0248539A1公开了一种利用来自于酿酒酵母的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，与化学法相比反应温和、环保；但是，该方法需要添加辅助的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖来实现辅酶的原位循环，造成生产过程中原料成本升高，不利于(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的大面积生产。

此外，公开号为CN102965403A的专利也提供了一种(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。该专利以(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯为底物，以培养并诱导含有酮还原酶基因重组大肠杆菌表达产生的重组酮还原酶冻干粉为催化剂，制备获得(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯。虽然通过该制备方法可顺利制备(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯，但该制备方法所需底物(S)-6-氯-5-羰基-3-羟基己酸叔丁酯仍需要通过化学方法制备获得，无法实现从6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯到(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的一步化生产，增加了工艺流程，同样提高了生产的成本。

因此，如何能够实现从6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯到(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的一步化生产过程，简化生产工艺，避免额外辅酶的添加，降低(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的生产成本，将是一个有待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用工程菌制备(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的一步化制备方法，简化制备工艺，降低生产成本。

一种工程菌，其特征在于，包含醇脱氢酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、羰基还原酶基因。

所述羰基还原酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。所述工程菌含有表达载体pET-30a(+)、表达载体pACYCDuet-1，所述醇脱氢酶基因连接在表达载体pET-30a(+)上，所述葡萄糖脱氢酶基因、羰基还原酶基因连接在表达载体pACYCDuet-1上。作为优选，醇脱氢酶基因采用adhR基因，葡萄糖脱氢酶基因采用gdhBS基因，羰基还原酶基因采用Cr基因；adhR基因、gdhBS基因和Cr基因分别从Lactobacillus kefir DSM20587菌、Bacillus subtilis168菌和CandidiamagnoliaeDSM20587菌中克隆获得。

宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

所述醇脱氢酶基因、葡萄糖脱氢酶基因和羰基还原酶基因在宿主细胞中共表达，使工程菌分泌醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶，本发明的反应式为：