[发明专利]一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法

说明书

技术领域

本发明公开一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，属于造影剂的制备方法技术领域。 

背景技术：

目前USPIO造影剂的制备方法主要为水相化学沉淀法和有机热分解法。水相化学沉淀法该方法简便易行，但对粒子尺寸和尺寸分散性的调控较差，因此其获得的粒子多具有较大的分散度。而有机热解法制备的USPIO粒子尽管尺寸分布均匀，可以较好的解决20 nm以下USPIO粒子的制备问题，但其规模化制备目前还存在一些问题，如修饰方法复杂，胶体稳定性较差等。同时目前USPIO的包覆和表面修饰多利用葡聚糖等多糖类大分子来提高其胶体稳定性，保障其在体内正常循环代谢，但其和氧化铁粒子表面作用力较弱，包覆稳定性较差，而且表面不具有特异性的基团，能通过被动的被网状内皮细胞或淋巴细胞吞噬而进入组织，缺乏特异性。

从目前的研究趋势看，开发适于规模化生产、能够较好的调控USPIO粒子尺寸、尺寸分散性和表面性质的制备方法对基于USPIO的MRI造影剂的研发和应用具有重要意义。同时，鉴于新型造影剂的开发更强调主动性、特异性造影功能，因此，本发明通过改进的水相化学沉淀法，可以“一锅”实现尺寸可控的USPIO合成及生物小分子的特异性修饰。 

发明内容：

本发明公开一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，解决了常规制备过程中修饰方法复杂，胶体稳定性较差等问题。

本发明提供一种一锅法制备多肽修饰超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体方法，具体步骤包括： 

1）在55℃~65℃下，将不同分子量的多肽分子和Fe（II）和Fe（III）铁盐混合溶于水中，形成络合物溶液；其中，

多肽分子与Fe（II）和Fe（III）铁盐总和的摩尔比为（5~10）：1；

Fe（II）和Fe（III）铁盐的摩尔比为1：2；

2）在60^oC下向步骤1）得到的络合物溶液中加入浓氨水，氨水与铁盐的摩尔比为5：1；

3）将步骤2）混合溶液在80^oC 、1000转/分条件下机械搅拌下反应30分钟，得多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体；

4）将步骤3）所得产物溶于保存在20毫升0. 05摩尔pH值为7. 3的HEPES缓冲溶液中。

所述的多肽分子选自与Fe离子具有较好络合能力且具有一定生物活性的聚氨基酸分子，包含聚赖氨酸（分子量70000～1500000KD）、聚天冬氨酸（分子量4000～9000KD）、聚谷氨酸（分子量20000～50000KD）等； 

所述的Fe（II）铁盐，指的是水溶性亚铁盐，如氯化亚铁、硫酸亚铁、硝酸亚铁、草酸亚铁等；

所述的Fe（III）铁盐，指的是水溶性铁盐，如、硫酸铁、硝酸铁、草酸铁等。

所述的超顺磁性氧化铁纳米粒子聚集体的尺寸可通过改变多肽分子的分子量以及多肽分子和铁盐比例来调控；聚集体尺寸随多肽分子量增大而增大，在6 nm～200 nm间调控。 

本发明多肽修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的效果证明：

通过透射电镜、激光粒度仪等测试了所合成的纳米粒子的大小及胶体稳定性，并以日本大耳兔及Balb/c小鼠为动物模型，测试了所得造影剂的生物相容性，生物毒性及其造影能力。

透射电镜 (T E M) 观察结果表明，多肽修饰前后 US P I O纳米粒子的尺寸和形貌无明显变化， 统计结果表明， 激光粒度仪测量大部分粒子尺寸范围为6～ 14 n m。共沉淀方法制备的USPIO胶体稳定性较差，在溶液中易于聚集而发生沉淀。多肽修饰后的USPIO胶体聚集沉淀速度明显减慢，因此胶体稳定性得到了提高。电位测量结果( 图2 ) 表明， 随着多肽修饰量的增加，USPIO表面负电荷增加，在多肽浓度为0.020mol／L时达到最低点， 进一步增加多肽的浓度， 其表面负电荷又略有减少。不同 p H下电位测量结果表明， USPIO的等电点为7 ；而用0.020mol／L的多肽修饰后，USPIO等电点降低到2 ，与多肽侧链羧基的p K a ( 2.2 7 ) 相近，表明此时多肽在USPIO表面形成了比较致密的修饰层。多肽修饰后，USPIO表面负电荷增加，等电点从 p H中性区移至酸性区，有利于改善USPIO在生理条件下的胶体稳定性。 

核磁检测及图像数据处理和分析