[发明专利]基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体及其应用

说明书

技术领域

 本发明涉及生物基因治疗技术，特别是一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体及其应用。

背景技术

目前应用于基因治疗的载体主要分为两类，即病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体虽然具有高效的转染效率，但其安全性低、免疫原性高且制备复杂。与病毒类载体相比，非病毒基因载体由于其低免疫原性、良好的生物相容性以及令人满意的基因负载能力，在近几年被广泛的研究。聚乙烯亚胺(PEI)是一种常用的阳离子聚合物非病毒基因载体，它是由单体(-CH₂-CH₂-NH-)构成的具有伯胺、仲胺和叔胺基团的水溶性聚合物。PEI单体中每3个原子含1个胺基，这些胺基的pKa值各有不同，使聚乙烯亚胺（PEI）几乎在任何pH条件下都有被质子化的可能，从而使其富含正电荷，能够较强的结合DNA和粘附细胞作为基因传递的载体。尤其是分子量为25 kDa的支链型聚乙烯亚胺常被作为非病毒基因载体的黄金标准。聚乙烯亚胺的转染效率受其分子量的影响，高分子量的聚乙烯亚胺虽然具有高效的转染效率，但是由于其自身大量正电荷的存在以及其非生物降解性，使其具有较高的细胞毒性。目前，最有效的方法之一就是利用可降解的共价键将低分子量的聚乙烯亚胺连接起来，这样既可以降低其毒性又可以保持其具有高效的转染效率。与共价键相比，超分子非共价键相互作用具有方便的合成方法、可控的分子识别、合适的键合常数以及容易自聚集等优点。环糊精由于其令人满意的水溶性、良好的生物相容性以及非免疫原性被广泛的用在生物领域。此外，环糊精和客体分子的诱导聚集为构建高效的基因载体提供了一种简单方便的方法。因此，将主客体诱导聚集应用到非病毒类基因载体的构建上具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体及其应用，该聚集体基于桥式双环糊精和金刚烷聚乙烯亚胺主客体诱导聚集构筑，可以有效的凝聚并且负载DNA，并且由于聚集体中二硫键的存在，进入细胞后在高浓度的谷胱甘肽作用下可以降解且转染效率高、毒副作用低、制备方法简单、产率较高，适于放大合成和实际生产应用。

本发明的技术方案：

一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其构筑单元以胱氨酸桥式双β-环糊精为主体（LCD），以金刚烷聚乙烯亚胺为客体（PEI-Ada），通过主客体诱导聚集构筑的二元超分子聚集体并可有效的凝聚质粒DNA，其中胱氨酸桥式双β-环糊精的化学分子式为C₄₈H₈₄N₂O₂₂S₂，金刚烷聚乙烯亚胺平均一条高分子链上修饰13.7个金刚烷单元，该聚集体构筑单元的结构如下：

。

 

所述聚集体与质粒DNA氮/磷比为20时，所形成纳米粒子的粒径大小为83 nm，表面电势为27.2 mV，能够有效地通过静电相互作用与带负电的质粒DNA形成复合物。

一种所述基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体的制备方法，包括以下步骤：

1）在氮气氛围下，将金刚烷乙酸溶于无水乙醇中得到金刚烷乙酸-乙醇溶液，然后将溶有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液加入到上述金刚烷乙酸-乙醇溶液中，搅拌反应30 min，得到反应液；

2）将分子量为10000的聚乙烯亚胺溶于无水乙醇中，加入到上述反应液中，在25℃条件下搅拌24小时，然后装入截留范围为8000-14000的透析袋中连续透析5天，将所得透析液冻干后即可制得金刚烷修饰聚乙烯亚胺（PEI-Ada）；

3）将上述金刚烷修饰聚乙烯亚胺溶于水中，然后加入胱氨酸桥式双β-环糊精并混合均匀，即可制得基于主客体诱导聚集构筑的聚集体。

所述金刚烷乙酸-乙醇溶液中金刚烷乙酸与乙醇的用量比为0.058 mol/L；在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐-N-羟基琥珀酰亚胺-乙醇溶液中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的用量比均为0.151 mol/L；反应液中金刚烷乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.58 ：0.754 ：0.754。

所述聚乙烯亚胺和乙醇的用量比0.001 mol/L，金刚烷乙酸与聚乙烯亚胺的摩尔比为0.58 ：0.01。