[发明专利]一种整体胚胎免疫染色试剂盒及其使用方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种整体胚胎免疫染色试剂盒及其使用方法和用途。

背景技术

传统的免疫荧光染色通过免疫化学的方法，实现组织或细胞中特异抗原抗体的结合，对某一蛋白分子或多种蛋白分子实现荧光标记，达到定性、定量分析目的，并可将标记荧光素的二抗直接结合到一抗上，通过荧光吸收光进行检测。近年来，免疫组化逐渐应用到对早期胚胎的整体染色，完整地对神经纤维、器官、干细胞迁移等进行标记，但目前应用的整体胚胎的免疫荧光化学染色因固定后胚胎中残留PFA对荧光素的吸收导致背景荧光干扰，使得后期图片采集及数据处理都受到很大的影响；因目前配方的缺陷，导致胚胎在免疫杂交过程中受到不同程度的损伤，影响整体胚胎染色效果；另外，目前广泛应用的整体胚胎荧光化学染色方法，配方方法复杂凌乱、复杂、耗时长。

发明内容

本发明专利的目的在于提供一种试剂盒及染色方法在一个反应相中对脊椎动物早期胚胎、神经纤维、神经干细胞的整体免疫荧光染色的应用。

本发明专利主要是通过快速便捷的操作方法，对胚胎实行整体胚胎神经纤维、神经干细胞以及其他组织的荧光染色。无背景干扰、不损坏胚胎完整性。用于胚胎发育早期神经系统、心血管系统等多种系统的形态学研究。

本发明采用如下技术方案：

本发明的整体胚胎免疫染色试剂盒，是由固定液、漂白液、封闭液和抗体稀释液组成，各试剂的体积比组成如下：固定液：甲醇75-85％、二甲基亚砜15-25％；漂白液：甲醇65-75％、二甲基亚砜15-25％、双氧水5-15％；封闭液：PBT稀释的1-5％马血清+1-5％牛血清白蛋白；抗体稀释液：PBT+1-2.5％牛血清白蛋白+0.2-0.4％NaN₃。

所述的双氧水的浓度为30％。

PBT是由1×磷酸盐缓冲溶液和0.01-0.1％的吐温20组成，其中磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2；优选PBT是由1×磷酸盐缓冲溶液和0.02％的吐温20组成，其中磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2。

本发明的整体胚胎免疫染色试剂盒的染色方法步骤如下：

固定：将胚胎放入加入固定液的带盖试管中(试管材质不限)。4℃固定1-7天。

漂白：倒掉固定液，加入漂白液，4℃固定12-24h。

复水：倒掉漂白液，加入100％甲醇震荡清洗3×10-30min(根据胚胎大小而定)，倒掉清洗液，加入50％甲醇震荡清洗3×10-30min(根据胚胎大小而定)，加入PBT4℃震荡清洗6×1h。

封闭：倒掉反应相中的清洗液，加入封闭液，4℃2-4h或室温30分钟震荡封闭(根据胚胎大小而定)。

一抗杂交：按照抗体说明书及参考文献，将合适量的一抗加入抗体稀释液，在反应相中加入稀释过的一抗溶液。冰上震荡孵育8-20h或过夜。

清洗：加入PBT4℃或冰上震荡清洗6×1h。

二抗杂交：按照抗体比例，将荧光二抗加入抗体稀释液，在反应相中加入稀释过的二抗溶液。4℃避光震荡孵育12-24h或过夜(将试管包裹在铝箔纸中)。

清洗：加入PBT4℃震荡清洗6×1h(或4℃过夜)

成像：激光共聚焦显微镜或双光子显微镜成像效果更佳(具体选择根据荧光强度及胚胎大小而定，胚胎较小用双光子显微镜，较大用共聚焦显微镜)。

本发明的积极效果如下：

本发明的整体胚胎免疫染色试剂盒及其使用方法具有以下优点：1、设备简单，操作简便，只需要在一个反应相中即可完成；2、费用低廉，除抗体外，其他均为实验室常规试剂，无特殊污染物残留；3、染色效果好，无背景荧光杂色干扰，且组织完整性好。

附图说明

图1是鸡胚整体胚胎的免疫荧光染色的图。

图中白色部分为3A10抗体标记的副神经及脊神经的神经纤维。Delete NC表示对该胚胎神经嵴细胞行显微切除。D为背侧；V为腹侧；R为头侧；XI表示第十一对脑神经副神经。

图2是鸡胚的神经轴突寻路特征的荧光染色图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

本发明的整体胚胎免疫染色试剂盒，是由固定液、漂白液、封闭液和抗体稀释液组成，各试剂的体积比组成如下：固定液：甲醇75％、二甲基亚砜25％；漂白液：甲醇65％、二甲基亚砜25％、双氧水10％；封闭液：PBT稀释的1％马血清+5％牛血清白蛋白；抗体稀释液：PBT+1％牛血清白蛋白+0.4％NaN₃。

所述的双氧水的浓度为30％。