[发明专利]一种整体胚胎免疫染色试剂盒及其使用方法和用途

权利要求书

1.一种整体胚胎免疫染色试剂盒，所述的试剂盒是由固定液、漂白液、封闭液和抗体稀释液组成，其特征在于：各试剂的体积比组成如下：固定液：甲醇75-85％、二甲基亚砜15-25％；漂白液：甲醇65-75％、二甲基亚砜15-25％、双氧水5-15％；封闭液：PBT稀释的1-5％马血清+1-5％牛血清白蛋白；抗体稀释液：PBT+1-2.5％牛血清白蛋白+0.2-0.4％NaN3。

2.如权利要求1所述的整体胚胎免疫染色试剂盒，其特征在于：所述的双氧水的浓度为30％。

3.如权利要求1所述的整体胚胎免疫染色试剂盒，其特征在于：PBT是由1×磷酸盐缓冲溶液和0.01-0.1％的吐温20组成，其中磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2。

4.如权利要求1所述的整体胚胎免疫染色试剂盒，其特征在于：PBT是由1×磷酸盐缓冲溶液和0.02％的吐温20组成，其中磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2。

5.如权利要求1-4任一项所述的整体胚胎免疫染色试剂盒的染色方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1)固定：将胚胎放入加入固定液的带盖试管中，4℃固定1-7天；

(2)漂白：倒掉固定液，加入漂白液，4℃固定12-24h；

(3)复水：倒掉漂白液，加入100％甲醇震荡清洗3次，每次10-30min，倒掉清洗液，加入50％甲醇震荡清洗3次，每次10-30min，加入PBT4℃震荡清洗6次，每次1h；

(4)封闭：倒掉反应相中的清洗液，加入封闭液，在4℃下2-4h或室温下30min震荡封闭；

(5)一抗杂交：将一抗加入抗体稀释液，在反应相中加入稀释过的一抗溶液，冰上震荡孵育8-20h或2-8℃冰箱震荡过夜；

(6)清洗：加入PBT4℃或冰上震荡清洗6次，每次1h；

(7)二抗杂交：按照抗体比例，将荧光二抗加入抗体稀释液，在反应相中加入稀释过的二抗溶液，4℃避光震荡孵育12-24h或将试管包裹在铝箔纸中过夜；

(8)清洗：加入PBT4℃震荡清洗6次，每次1h或4℃过夜；

(9)成像：将步骤(8)清洗后的反应相使用激光共聚焦显微镜或双光子显微镜成像。

6.如权利要求1-4任一项所述的整体胚胎免疫染色试剂盒在一个反应相中实现脊椎动物早期胚胎、神经纤维、神经干细胞及其他组织器官的整体免疫化学染色的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的染色试剂盒同时在一个反应相中加三种以上不同来源的一抗，及三种以上对应的二抗来实现多抗体杂交。