[发明专利]一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

骨骼肌的形成是一个连续的生理过程。胚胎期，骨骼肌成肌细胞增殖、分化、融合为初级肌管并逐步成熟；出生后，肌纤维的数目虽然不再改变，但当肌肉组织受损时，静息的卫星细胞被激活，进而分裂、融合形成新的肌管，骨骼肌得以再生。依靠现代细胞分离、培养技术，研究人员能够利用胚胎成肌细胞或成体卫星细胞体外培养获得初级肌管。

动物的各种运动依赖于骨骼肌的收缩，而肌肉收缩所必需的能量均来源于ATP，骨骼肌肌球蛋白Ca²⁺—ATPase通过控制横桥ATP的分解速率，从而影响肌肉的张力和收缩速度。Peter等(Peter等，1972)根据肌球蛋白ATPase的活性把骨骼肌纤维分为3种类型：慢收缩氧化型(I型)、快收缩氧化酵解型(IIa型)和快收缩酵解型(IIb型)：I型肌纤维的线粒体含量丰富，有氧代谢酶活性高，主要通过有氧代谢获取能量，由于参与肌纤维收缩的ATPase的活性较低，I型肌纤维收缩慢但持久；IIb型肌纤维ATPase和无氧代谢酶的活性较高，线粒体含量较少且有氧代谢酶的活性很低，主要依靠无氧代谢获取能量，因此IIb型肌纤维收缩快却不持久、易疲劳；IIa型肌纤维ATPase含量居中，既可以利用有氧代谢供能，又可以依赖糖酵解供能。肌肉纤维的类型不仅决定着肌肉的代谢及运动特征，还影响其色泽、嫩度、系水力等肉用品质。目前，对肌肉纤维类型及其代谢机制的的研究涉及农业生产、医疗卫生、运动生理等众多领域。

尽管骨骼肌的分类及其特征已经明确，但各类型肌纤维的先天形成机制仍不清楚，究其原因是现有研究结果及手段尚不能解析骨骼肌代谢模式建立的遗传机制。然而越来越多的证据表明，后天因素也可以影响骨骼肌纤维的构成类型，如神经支配、持久性运动训练、机械性负重、激素水平改变、肥胖、糖尿病、衰老等生理、病理变化均会导致肌纤维由II型向I型或者由I型向II型转变(Pette和Staron2001；Zierath和Hawley2004)。体内研究显示，肌纤维类型的转化受到多条信号通路的共同调控，包括Ras/MAPK信号通路、腺苷酸激活的蛋白激酶信号通路、PGC-lα/β通路、Myostatin和Wnt信号通路、CaN/NFAT信号通路等(Rockl等，2007；Takeda等，2009；Hanke等，2011)。

尽管体内实验可以更好地模拟机体的生理状态，但也给相关机制的研究增加了复杂性。因此建立高效、稳定的骨骼肌细胞分离、培养甚至定向诱导体系将为进一步阐述骨骼肌纤维形成、转化机制及其能量代谢规律奠定基础。上述问题的阐述也将为畜牧生产中家畜肉质改良、医疗上骨骼肌功能性再生、竞技体育中运动生理学的研究提供有益参考。

虽然目前研究人员利用胚胎成肌细胞或成体卫星细胞进行体外培养可以获得肌管，但所得肌纤维类型随机性强，氧化代谢能力普遍较低。并且，现有技术大都借助基因工程手段进行特定基因的干扰或过表达可以引起动物骨骼肌纤维类型或氧化代谢水平的改变(Semsarian等，1999；Lin等，2003；Shinichiro等，2008)，尚未欠缺基于骨骼肌细胞非转基因的定向诱导平台，为了进一步满足未来在医疗、畜牧业生产等领域应用的需要，骨骼肌细胞非转基因定向诱导平台的建立更具有实际意义。

发明内容

本发明提供了一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，是从鸡胚胎中分离纯化鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞，将成肌细胞接种于Transwell Insert的PET膜上进行增殖培养，同时将肌源成纤维细胞经过传代培养后接种于Transwell Insert培养皿上培养，再将经过增殖培养的成肌细胞转接入含有肌源成纤维细胞的Transwell Insert培养皿中，加入含有H₂O₂的分化培养基进行分化培养。

所述方法的步骤如下：

1)成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从鸡胚胎中分离纯化骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞；

2)成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞接种到经过0.1％明胶处理的Transwell Insert的PET膜上，加入增殖培养基，获得增殖成肌细胞；