[发明专利]一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法

权利要求书

1.一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，其特征在于，从鸡胚胎中分离纯化鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞，将成肌细胞接种于Transwell Insert的PET膜上进行增殖培养，同时将肌源成纤维细胞经过传代培养后接种于Transwell Insert培养皿上培养，再将经过增殖培养的成肌细胞转接入含有肌源成纤维细胞的Transwell Insert培养皿中，然后加入含有H₂O₂的分化培养基进行分化培养。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从鸡胚胎中分离纯化骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞；

2)成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞接种到经过0.1％明胶处理的Transwell Insert的PET膜上，加入增殖培养基，获得增殖成肌细胞；

3)肌源成纤维细胞的培养：将步骤1)所得的肌源成纤维细胞进行3-5代传代纯化培养后，接种到Transwell Insert培养皿内，37℃下培养1d后，去除培养基并用PBS清洗；

4)将步骤2)所得的增殖成肌细胞转接入步骤3)的Transwell Insert培养皿中，加入含有H₂O₂的分化培养基，培养期间每隔24-48h半量换液，每隔8-12h，进行1次低温冲击刺激，分化培养后获得骨骼肌的多核肌管。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述鸡胚胎为孵化11日龄的鸡胚胎。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述成肌细胞，接种密度为5000个/cm²，所述PET膜为1μm孔径的PET膜；所述增殖培养，所用培养基为含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述增殖培养，培养温度为37℃，培养时间为3-4d，CO₂体积浓度为5％。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述接种到Transwell Insert培养皿中37℃下培养1d，成纤维细胞接种密度为2000个/cm²，所用培养基为含有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述H₂O₂的浓度为20-80μM；所述分化培养基为含有2％马血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基；所述低温冲击刺激是指将培养物置于16℃低温孵育15-60分钟；所述培养，培养温度为37℃，CO₂体积浓度为5％，培养时间为7-10d。

8.权利要求7所述方法，其特征在于，所述H₂O₂的浓度为60μM；所述16℃低温孵育，孵育时间为30分钟。