[发明专利]一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法

说明书

技术领域

    本发明属于基因工程技术领域，涉及一种人胞质凝溶胶蛋白（human cytoplasmic gelsolin，简称hcGSN）的表达纯化方法，包括其工程菌的构建、重组人胞质凝溶胶蛋白的表达和纯化。

背景技术

凝溶胶蛋白普遍存在于细胞、血液和脑脊液中，是一种多功能的肌动蛋白结合蛋白。凝溶胶蛋白的经典功能是调节肌动蛋白丝聚合、解聚和剪切，从而在细胞骨架结构重排和细胞运动等过程中发挥重要作用。同一个凝溶胶蛋白基因由于外显子的不同剪接方式，产生了两种形式的凝溶胶蛋白，包括胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白。血浆凝溶胶蛋白比胞质凝溶胶蛋白在N端多出25个氨基酸残基，其余氨基酸序列完全相同。大量研究证据表明凝溶胶蛋白与多种疾病的发生和发展密切相关。目前血浆凝溶胶蛋白被应用于治疗感染、急性损伤和脓毒症等。

最新的研究发现，胞质凝溶胶蛋白与肿瘤和阿尔茨海默症等疾病相关。与正常组织相比，胞质凝溶胶蛋白在多种癌变组织中的表达呈下降趋势，如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肠癌及肺癌等。当癌细胞中过量表达胞质凝溶胶蛋白时，细胞集落的形成显著受到抑制。此外，胞质凝溶胶蛋白可能通过抑制癌细胞的生长来抑制机体内肿瘤的生长和转移等。阿尔茨海默症是一种以学习、记忆和认知障碍为主要特征的神经退行性疾病，其特征包括细胞外老年斑、细胞内神经纤维缠结和神经元丢失等。阿尔茨海默症患者脑中老年斑的主要成分是β-淀粉样肽。目前已有多个研究小组尝试使用凝溶胶蛋白来治疗阿尔茨海默症，并且一致发现胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白都能够清除阿尔茨海默症中的老年斑，降低β-淀粉样肽的水平。

未来胞质凝溶胶蛋白有望被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。因此，在体外过量表达并大量纯化胞质凝溶胶蛋白将为相关研究奠定基础。但是目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。因此，需要对该蛋白的表达纯化方法做进一步的改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，解决目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。

本发明通过以下技术方案来实现：一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，该方法包括以下步骤：

（1）构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因（hcGSN）的重组表达载体pET-15b-hcGSN，主要是以人血浆凝溶胶蛋白cDNA（GenBank: X04412.1）为模板，通过设计上游引物FW(hcGSN)：5′- CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC -3′和下游引物RV(hcGSN)：5′-CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3′，PCR获取人血浆凝溶胶蛋白基因，构建入表达载体得pET-15b-hcGSN；

（2）将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株；

（3）将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37℃诱导表达4小时；

（4）5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清；

（5）将上清上样于镍离子亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow，纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。

进一步的，在所述的His标签与hcGSN的氨基酸序列之间还设计有凝血酶的切割位点，即Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。

采用上述技术方案的积极效果：本发明利用了基因工程的方法，诱导表达人胞质凝溶胶蛋白，并利用镍离子亲和层析一步纯化等简便技术，可以得到较高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白；本发明实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化后每升发酵液可以获得30mg带有His标签的重组蛋白hcGSN。在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点（Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser），需要时可以使用凝血酶去除His标签；该方法提供了一种高效生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，采用大肠杆菌表达系统，能够快速、简便、稳定地获得高纯度的人胞质凝溶胶蛋白。

附图说明

图1通过菌落PCR方法鉴定转化有重组质粒pET-15b-hcGSN的阳性克隆，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道1为阳性克隆的菌落PCR产物；