[发明专利]一种角膜的脱细胞方法

说明书

技术领域

本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种角膜的脱细胞方法。

背景技术

角膜病是全球范围内第二致盲眼病，并且以每年150～200万病例的速度递增。角膜移植是目前治疗角膜盲唯一有效的方法，但供体角膜来源的极端匮乏制约着角膜移植的开展。角膜基质如动物等动物的角膜基质具有与人角膜基质类似的组织结构、生物物理特性和光学特性，但异种移植后强烈的排斥反应阻碍了异种角膜在临床上的应用。近年来的研究发现，角膜基质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要抗原，而作为角膜基质架构的胶原纤维在种系间高度保守，抗原性很低，无细胞的异种角膜移植后不产生排斥反应。因此，将动物的基质细胞完全脱去，使之成为无细胞的角膜基质可能是人角膜基质的理想替代物。

但现有技术生产的无细胞角膜基质在脱细胞过程中，采用的是胰酶、EDTA(乙二胺四乙酸)等溶液以及Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)、脱氧胆酸钠、SDS(十二烷基磺酸钠)等表面活性剂，此类方法虽然能去除细胞成分，但反应剧烈，对角膜基质破坏严重，其中使用胰酶处理易导致角膜基质降解，使用表面活性剂易导致表面活性剂残留，产生细胞毒性，在移植后容易引起毒性反应，不能达到良好的生物相容性。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种去除角膜中免疫原细胞成分和可溶性蛋白的同时能够完整保留角膜基质胶原结构的角膜脱细胞方法，从而提高脱细胞角膜基质的生物相容性和抗降解能力。

为了实现上述目的，本发明提供一种角膜的脱细胞方法，包括以下步骤：

A、将摘取的动物角膜置于水中，振荡处理，以使上皮层脱落；

B、将所述角膜置于脱细胞试剂中，振荡处理；

C、将所述角膜置于水中，振荡处理；

D、交替重复步骤B和步骤C，以使基质细胞和内皮细胞脱落；

其中，所述脱细胞试剂含有NaCl和EDTA。

优选地，所述脱细胞试剂为：浓度为2～5mol/L的NaCl溶液与浓度为0.5～5g/L的EDTA溶液的混合液。

优选地，所述脱细胞试剂的PH值为7.0～7.4；所述脱细胞试剂和/或水的温度为2～37℃。

优选地，所述NaCl溶液的浓度为3mol/L，所述EDTA溶液的浓度为3g/L。

优选地，所述步骤A的振荡时间为5～10h，期间，每隔1～2h更换一次水。

优选地，所述步骤B的振荡时间为1～2h。

优选地，所述步骤C的振荡时间为1～2h。

优选地，在实施所述步骤D的持续时间内，每隔1～2h更换一次脱细胞试剂或水。

优选地，所述步骤A、步骤B、步骤C或步骤D的振荡转速为100～200rpm。

本发明采用物理脱细胞方法，通过脱细胞试剂和水的交替使用，反复改变组织渗透压，能够有效的去除容易引起免疫反应的角膜细胞成分和可溶性蛋白，同时，本发明所使用的试剂温和，能够完整的保留角膜基质胶原结构。

附图说明

图1为本发明的角膜脱细胞方法一实施例的脱细胞处理前和脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片对比图，其中，1A为脱细胞处理前的苏木精-伊红(HE)染色照片图，1B为脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片图；

图2为本发明的角膜脱细胞方法一实施例的脱细胞处理前和脱细胞处理后的透射电镜照片对比图，其中，2A为脱细胞处理前的透射电镜照片图，2B为脱细胞处理后的透射电镜照片图。

图3为采用本发明的角膜脱细胞方法进行脱细胞之后，移植给兔的动物实验60天后的苏木精-伊红(HE)染色照片对比图，其中，3A为移植前且未经脱细胞处理的苏木精-伊红(HE)染色照片图，3B为经脱细胞处理移植后的苏木精-伊红(HE)染色照片图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施方式为实现本发明目的的最佳实施方式，其仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种角膜的脱细胞方法，在第一实施例中，所述角膜的脱细胞方法包括以下步骤：