[发明专利]一株能促进杉木生长的内生真菌

说明书

技术领域

该发明涉及一株能促进杉木生长的内生真菌（Cylindrocarpon sp.），包括其分离、提纯、接种与培养接及其应用方法。

背景技术

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。

谢卿媚和黄建河（1985）对杉木内生菌根的形态特征及菌根真菌的鉴定，主要以杉根皮层组织与内生菌根真菌的共生结构作解剖学分析及以湿筛—倾析法从根际土中获得的菌丝与厚垣孢子进行观察。结果表明，根据杉木内生菌根的解剖学分析与根际土壤中厚垣孢子的形态结构特征，确定杉木内生菌根是属于泡囊一丛枝型内生菌根（简称VA菌根）。进一步研究杉木内生菌根对杉木的生长发育及抗性方面的效应，充分合理的利用内生菌根制剂促进杉木生长的问题，具有重大的经济价值。特别是在我国南方养分瘠薄的红壤地区，研究内生菌根增强土壤中磷素的吸收，是当前南方红壤地区杉木速生丰产中亟待解决的重要问题。综上可知，关于杉木的内生真菌方面的研究仅从根部位进行鉴定研究，而对杉木叶部位和茎部位均未涉及内生真菌的研究。此外，有关内生真菌对杉木自身生长的影响研究还存在空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能促进杉木生长的内生真菌，提供一株能促进杉木生长的内生真菌分离、提纯、培养及其应用方法。

本发明提供的一株能促进杉木生长的内生真菌（Cylindrocarpon sp.），从杉木根部分离、纯化获得，其菌落呈柔软的绒毛状、分生孢子座方式产孢。瓶梗圆柱形，具有开放的顶孔和短的领状物，从中产生无色的、壁光滑的粘质状的分生孢子。大分生孢子，圆柱形，两端钝圆，弯曲，有一个横隔膜。该真菌为柱孢属（Cylindrocarpon sp.）CG2菌株，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.9188。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

该菌的分离、纯化包括：

A、材料：将采集得到不同年份的根、茎段、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；

B、消毒：70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；

C、接种部位的选择：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝条：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；

D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Cylindrocarpon sp.功能菌株；

点接种纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。