[发明专利]一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其应用

说明书

技术领域

    本发明涉及一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其提高氨基酸产量的应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。 

背景技术

    氨基酸是构建生物体的众多活性大分子之一，是构建细胞、修复组织的基本材料。氨基酸能够为机体和大脑活动提供能源。构成蛋白质的基本氨基酸有21种，有8种氨基酸人体不能自身合成，需从食物中获取，为人体的必需氨基酸；另外人体自身合成的精氨酸、组氨酸不能满足机体的需要，也需要从食物中摄取。氨基酸的平衡和适量供应是人体健康的基本前提，任何一种氨基酸的缺乏，都会影响免疫系统和其他正常功能的发挥。因此氨基酸在食品、医药保健、饲料方面有很广泛的应用。 

    目前氨基酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、化学合成法和微生物发酵法。蛋白质水解提取法是在酸性条件下，将动植物组织水解，得到各种氨基酸混合物，经分离、纯化、精制等工序获得所需的氨基酸。但天然蛋白质的氨基酸组分复杂，提取分离难度较大，故目前生产上较少采用该方法。化学合成法虽然纯度较高，但是反应需高温高压条件，能耗大，成本高，得率较低，并且在生产工艺中涉及到了有毒有害有机溶剂的使用，安全性差，要得到具有营养价值的氨基酸，必须进行光学异构体的拆分。但是这种拆分工艺复杂，收率又低，一般也不采用。微生物发酵法是利用微生物自身酶系的催化功能，生物合成并过量积累氨基酸，具有原料成本低，生产周期短，环境污染小和产物纯度高等优点，是一种经济实用的生产方法。此外，谷氨酸棒杆菌被认为是安全的食品级生产菌株，被广泛用来生产谷氨酸，赖氨酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸等，谷氨酸棒杆菌以其生产氨基酸安全性佳，且产生的氨基酸不被降解的特点，在生产食用和医用氨基酸中具有巨大潜力。国外主要采用发酵法生产氨基酸，国内的菌种在产量方面还低于世界先进水平，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株， 进一步提高氨基酸的产量，具有重要的经济价值和社会意义。 

发明内容

    本发明提供过表达fusA基因提高氨基酸产量的方法及其应用，与出发菌株相比实例菌株的氨基酸产量得到了显著提高。 

    fusA基因编码延伸因子EF-G。延伸因子EF-G的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。EF-G是一种GTP酶，蛋白质合成时，EF-G帮助核糖体在mRNA上易位。作为一种机动蛋白，驱使着tRNA和mRNA在核糖体上的定向移动。EF-G与转位前复合物的相互作用能够加速转位的进行，使速度提高1000 倍，加速了核糖体的利用效率和蛋白合成速度，可以使编码氨基酸合成的关键酶大量合成，从而提高氨基酸产量。 

    本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 

一株过表达fusA基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum subspecies lactofermentum）WY001/ pDXW-8-fusA，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.2014233。

延伸因子EF-G基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA的构建方法，利用PCR扩增克隆延伸因子EF-G基因fusA，将基因片段连接到[x1] pDXW-8，然后利用电转化的方法转化到谷氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA。 

    所述表达载体为诱导型表达载体。所述表达载体中的启动子为tac^*；表达载体的出发载体为pDXW-8。 

    延伸因子EF-G基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA的构建方法，步骤如下： 

（1）设计引物扩增fusA

上游引物：5’-CTAGCTAGCA GAAGGAGTAA ATCGGTGGCT CAAGAAGTGC TTAAG-3’，下划线为NheI酶切位点；

下游引物：5’-AACCCTCGAG TTAGGAAGCG GTGCCGTTGC-3’，下划线为XhoI酶切位点；