[发明专利]真菌免疫调节蛋白FIP-ppl及其基因

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl及其基因。

背景技术：

真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory proteins,以下简称为FIPs)是近年来从一些高等担子菌(食用菌类)子实体中提取的，与植物凝集素和免疫球蛋白结构和功能相似的一类小分子蛋白质。FIPs具有调节免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇和抑制机体自体免疫等多种重要的生理功能。

FIPs具有独特的生理功能，而且具有极强的稳定性和食用安全性，可以调节免疫力，抑制肿瘤发生，治疗过敏等。因此，FIPs即可以用作增强机体健康的保健品功能成分，还可以开发成预防和治疗疾病的天然药物。

目前世界上报道的FIPs种类较少，并且多数是从蘑菇中得到的。虽然真菌的种类繁多，但是由于食用菌含有大量多糖和其它杂质成分，且FIPs的相对含量较低，小肽制备、分析相对较难，导致FIPs蛋白的提取工艺复杂、周期长、成本高、得率低，因而严重影响和限制了新的FIPs的发现及其大量制备。而且，临床与医药应用均具有一定的剂量和纯度要求，若开发和应用此类药品，必须获得相当数量的蛋白质纯品。所以，真正能应用的FIPs较少。

因此，通过基因工程方法从已完成基因组测序的真菌中获得可开发利用的FIPs蛋白，既能丰富FIPs家族的种类，更能为人类健康的保健和治疗提供新的免疫调节剂。

发明内容：

本发明的目的是通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌的免疫调节蛋白，并将其应用于免疫调节和抗肿瘤药物的制备中。

本发明的目的还包括提供上述真菌免疫调节蛋白的基因、重组表达载体、重组菌株。

本发明的另一目的是提供上述真菌免疫调节蛋白的制备方法。

本发明人通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌Postia placenta Mad-698-R的免疫调节蛋白FIP-ppl，发现其适合于在保健品和医药中使用。

所述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl，全长125个氨基酸，理论分子量为14.738kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

FIP-ppl蛋白是一种新型的真菌免疫调节蛋白。本发明人通过将其cDNA序列推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现：FIP-ppl蛋白与小孢灵芝、赤灵芝、紫灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白GMI、FIP-gja、LZ-8和FIP-fve的序列同源性仅分别为58％、56％、54％和52％。说明FIP-ppl是一种新的真菌免疫调节蛋白。

本发明还提供并合成了编码上述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的基因：通过一对引物FIP-P-GST-F(EcoRI)：5'-GAA TTC ATT ACT TAT GTT CTT CAG G-3'和FIP-P-22b-R’(XhoI)：5'-CTC GAG TTA CTG GGA CTG GG-3'，用基因合成的方法克隆了这一真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的基因，DNA全序列分析结果表明，fip-ppl全长384bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了包含蛋白FIP-ppl基因的重组表达载体。方法是将本发明的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。优选的表述载体是pGEX-4T-1。

作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是pGEX-4T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达载体pGEX-fip-ppl。

将上述重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌。所述宿主细胞优选为大肠杆菌Rosetta，得到重组菌株ROS/GST-FIP-ppl。

本发明还提供了包含真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因的重组菌株，优选为重组菌株ROS/GST-FIP-ppl。

本发明还提供了制备真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的方法，包括以下步骤：

1)将含FIP-ppl基因的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的表达；以及

3)回收并纯化所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl。