[发明专利]一种桑椹表面致腐菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体是涉及桑椹表面致腐菌-链格饱属菌的筛选方法。

背景技术

桑椹含有丰富的还原糖、有机酸、维生素和各种矿物质以及花青素和白藜芦醇等功能成分，经常食用有利于提高人体免疫力、延缓衰老、美容养颜等,已被国家卫生部列为药食同源的食品。最新研究显示，桑椹还具有促进造血细胞生长、抗诱变、降血糖、降血脂、护肝等药理作用。桑椹属于浆果类，表皮极薄，果实柔软多汁、呼吸旺盛、果表面有柱状突起，成熟期短，成熟果实采摘或运输过程中极易受到损伤；加之桑椹成熟期正值高温天气，易受病原微生物感染，导致大量腐烂。但桑椹自身的防疫机制对大多数病原微生物都有一定的抵御能力，因此真正能够侵入桑椹内部致病的病原菌也只是极少数。筛选并鉴定出导致桑椹腐败的主要病原物，对建立有效的桑椹保鲜技术具有重要意义，已有的研究表明，致使桑椹腐烂的主要病原微生物为真菌，其次为细菌。

发明内容

本发明目的是提供桑椹表面致腐菌的筛选方法，操作简便，选择性强，分离效果优。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术步骤如下：

(1)致腐菌液的制备：取腐烂桑椹，切碎后置于无菌生理盐水中，浓度为20-25质量％，振荡培养，所得培养液即为致腐菌液；

(2)初筛培养基的制备：分别以果胶和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源，制备初筛培养基，具体是：称取果胶或CMC-Na0.5％，K₂HPO₃0.1％，(NH₄)₂SO₄2％，NaCl0.05％，琼脂1.8％，121℃灭菌20-25min即可，其中涉及的百分比为质量百分比；

(3)致腐菌落群培养：将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成浓度为10^-4,10^-5,10^-6，分别取1mL稀释液涂布于步骤(2)获得的初筛培养基上，并在27-28℃条件下培养72-78h，获得菌落群；

(4)单菌落培养：挑取步骤(3)获取的初筛培养基上长出的菌落，接种至含10wt％桑葚汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为致腐菌落。

(5)验证试验：

A.培养基验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落分别接种至含10％桑椹汁和不含桑椹汁的PDA培养基中，27-28℃培养箱中培养5-7天，观察接种圈生长情况，如果含10％桑椹汁PDA培养基中接种圈明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈大，则初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌。

B.桑椹验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落涂布于已处理的无菌桑椹表面，然后放至已灭菌的培养箱中，27-28℃培养5-7天，观察其腐败状态是否与初筛以前腐败状态一致，如果是，则初步验证所筛病原菌为桑椹致腐菌。

(6)致腐菌株种属特性的分子鉴定：

采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取致腐菌菌株总DNA；依据真核微生物18S rRNA保守性设计真菌通用引物；经PCR扩增，PCR扩增产物与pMD18-T载体的连接；细胞转化；基因克隆与测序，与GenBank数据库比对等分子生物学过程，验证该致腐菌的种属特性，证实该致病菌为链格饱属菌。

本发明的优点和有益效果：

1.由于桑椹表皮细胞壁含大量果胶和纤维素，因此发明人以果胶和纤维素为唯一碳源，进行培养基定向筛选，针对性强。

2.利用含桑椹汁的PDA培养基和不含桑椹汁的PDA培养基进行验证试验，以及无菌桑椹的体表验证，可初步判断所筛选微生物的来源。

3.分子生物学手段为鉴定所筛选的病原菌属性提供实质性证据。

附图说明

图1是在PDA培养基的接种圏示意图，其中，图1a是含桑椹汁的PDA培养基；图1b是不含桑椹汁的PDA培养基；从图中可见含10％桑椹汁PDA培养基中接种圈(82mm)明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈(18mm)大，初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌；

图2是所分离致腐菌菌丝的孢子图。图中可见，菌丝有横隔，孢子椭圆形，说明该致腐菌属真菌类。

图3是系统发育树分析图。

具体实施方式

实施例1

一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，步骤如下：