[发明专利]一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学检测和生化分析领域，更具体地，涉及一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

锌离子是仅次于铁离子之后人体内第二多的过渡金属离子。其在生物过程中主要以二价阳离子的形式存在并且在整个生物体系中发挥着十分重要的作用。研究表明锌离子能够与一些特定的蛋白质结合，作为其结构的辅助因子和催化中心，发挥酶的作用，另外脑功能、基因转移、免疫功能、神经信号传导等生物过程都和锌离子相关。所以锌离子的检测已经成为生物分析的一个重要研究方向，快速灵敏的进行锌离子检测在临床上具有重要意义。

    锌离子稳定的 d¹⁰电子结构使得许多光谱分析和电化学方法均不适于锌离子的检测，于是荧光分析方法就成为了锌离子检测的最好选择。荧光检测方法具有操作便捷、灵敏度高等优点，已经成为生物体内外各种金属离子检测的一种有力手段。基于光诱导电子转移的喹啉衍生物，由于其pH不敏感，能够与金属配位，光稳定性好等优点被广泛的用于生物体内锌离子检测。然而，大多数喹啉类的荧光探针在锌离子检测过程中往往存在复杂的合成过程，水溶性差，细胞通透性差，检测灵敏度低等缺点，限制了其在生物分析中的应用。另外，传统单发射荧光检测探针，往往易受检测环境、样品处理、仪器设备等因素的影响，其分析的精确性不易控制。

    比率荧光测定方法是荧光分析中一个重要的方法，它利用荧光探针的物质响应荧光信号与自身内标荧光的比值来进行待测物的定量分析。这种检测策略以相同背景下测定的荧光强度的比值作为信号参数，能够极大的消除背景荧光对检测信号的干扰，从而提高检测的灵敏度。这种双发射的比率荧光探针对于细胞内物质的传感检测具有十分明显的优势，如能够校正细胞中细胞液粘度、离子效应、pH、光散射等因素对荧光信号的干扰，有效的提高检测的准确性。因此设计合成比率型荧光探针具有很好的应用前景。纳米技术的兴起也极大的推动了新型荧光探针的制备和发展，构建新型纳米荧光探针对Zn²⁺进行检测已经引起广泛关注。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有锌离子荧光检测方法中喹啉衍生物水溶性差，细胞通透性差，单发射检测方法易受到复杂基质背景干扰，灵敏度不高的缺陷，提供一种基于双发射的比率荧光检测方法。所述方法将接枝氨基喹啉的树枝状聚乙烯亚胺衍生物共价连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子表面，利用氨基喹啉与锌离子特异性识别反应产生的在波长500 nm处的荧光与二氧化硅荧光纳米粒子在波长600 nm处固定不变的荧光的比值进行锌离子的灵敏检测，极大提高检测灵敏度，并可用于细胞中锌离子的实时成像。

    本发明首先提供一种比率荧光纳米探针，包括包埋有联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子，和通过共价键与二氧化硅荧光纳米粒子连接的水溶性锌离子识别探针。

    所述的水溶性锌离子识别探针是由氨基喹啉类衍生物与树枝状聚乙烯亚胺接枝形成。

    所述的氨基喹啉类衍生物为8-氯乙酰基氨基喹啉。

    根据需求再提供一种上述的比率荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

S1. 水溶性锌离子识别探针的合成：将氨基喹啉类衍生物、树枝状聚乙烯亚胺与无水碳酸钾混合，搅拌，进行接枝反应，加热在惰性气体保护下进行回流回收；

S2. 包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备；

S3. 比率荧光纳米探针的制备；将步骤S1所得的水溶性锌离子识别探针和步骤S2所得的二氧化硅荧光纳米粒子加入到磷酸缓冲液中，室温反应，即得。

    S2中所述的包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备采用油包水的反相微乳法制备。

    S3中所述的磷酸缓冲液含有N-羟基琥珀酰亚胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

    根据以上材料，再提供一种锌离子荧光检测方法，使用上述的比率荧光纳米探针。

    包括以下步骤：

SI. 体液中锌离子的检测：将比率荧光纳米探针加入到离心管中，加入不同浓度的锌离子，再用磷酸缓冲液定容，孵育，在365 nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm；