[发明专利]人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞及其制备方法。 

背景技术

白血病是危害青壮年的最主要恶性肿瘤之一，化学治疗目前仍然是白血病的最主要治疗方法，但化疗中抗癌药物诱导的药物耐受性，特别是获得性多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象是阻碍白血病治疗效果的主要障碍，也是目前尚未解决的难题。三氧化二砷是中药砒霜的有效成分，已在各型白血病和实体肿瘤的治疗中得到广泛应用，取得了良好的临床疗效。研究证实三氧化二砷不是耐药蛋白P-gp的底物且抑制P-gp表达，不与常规化疗药物发生交叉耐药性，故单用或与常规化疗药物联合应用在耐药性、复发性及难治性白血病的治疗中取得良好疗效。临床应用三氧化二砷治疗白血病/肿瘤过程中发现部分白血病/肿瘤细胞也会逐渐产生对三氧化二砷的耐受性，即获得抗砷性，发生机制以及与MDR的关系不明。当前常用的采用阿霉素诱导的、超表达P-gp的白血病多药耐药细胞系（如K562/ADM等）照样对三氧化二砷敏感、没有抗砷性。因此，研究化疗药物诱导的MDR的机制及与抗砷性的关系，以及预防抗砷性的产生，探讨耐药性白血病细胞对其敏感抑或耐受的细胞分子机制，可为解决含砷化疗药物耐药问题以及临床是否选择As2O3作为耐药性白血病的治疗药物提供实验依据或探寻新的治疗靶点。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，为分析白血病细胞化疗耐药后的生物学性状的变化，筛选及判断化疗药物的敏感性，分析白血病细胞多药耐药及抗砷性机制，研究多药耐药性与抗砷性的关系，预防白血病化疗过程中MDR和/或抗砷性的产生，体外筛选耐药调整剂，提供了一种可与三氧化二砷交叉耐药的白血病多药耐药细胞系HL-60/RS。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞，所述细胞株HL-60/RS的保藏编号为CCTCC NO：C201430，保藏时间为2014年4月16日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心（地址为中国.武汉.武汉大学）。 

本发明的第二个目的是提供了上述的人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞的制备方法，是以人类白血病HL-60细胞系为亲本细胞，采用阿霉素模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、长期、间歇性反复冲击加持续诱导的方法，诱导建立获得性白血病多药耐药细胞系HL-60/RS。 

其特点为对三氧化二砷具有高耐药性，并高表达MRP1、MRP2和ASNA1等砷转运相关蛋白。 

进一步的，上述的人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞的制备方法，包括以下步骤： 

1）取对数生长期的人类白血病HL-60细胞接种在含有以体积百分比计为15%的新生牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5% CO₂、饱和湿度环境下培养，得到细胞培养体系；

2）在步骤1）得到的细胞培养体系中加入阿霉素，起始冲击浓度为0.1mg/L，待细胞恢复正常生长时，再加以同浓度药物诱导，如此重复，直至细胞能在该浓度下正常存活和增殖时，再提高冲击药物浓度，进行第二轮冲击诱导，药物浓度增加的幅度为0.1mg/L；按上述方式反复间歇性冲击诱导，并随着冲击诱导次数及耐药性的增高，每轮药物浓度增加的幅度逐渐提高，初期幅度小，后期幅度加大，每轮冲击诱导药物浓度增加的幅度为0.1mg/L，0.2 mg/L，0.3 mg/L，0.5 mg/L，0.6 mg/L，0.8 mg/L，1.0 mg/L，1.5 mg/L，2.0 mg/L，2.5 m g/L，3.0 mg/L，3.5 mg/L，4.0 mg/L，5.0mg/L，每轮中同幅度增加冲击浓度的次数根据细胞状态及耐药稳定性决定，一般1-3次，冲击诱导时间为20个月，至最终人类白血病HL-60细胞能够在含有40.0mg/L阿霉素的细胞培养体系中维持存活和增殖；撤离诱导药物置于无药体系中培养，耐药性保持稳定，得到具有耐药性的HL-60/RS细胞。

所用药剂来源：

新生牛血清：兰州荣晔生物科技公司产品，批号20100925；

青霉素：华北制药股份有限公司产品，批号1105403；

链霉素：华北制药股份有限公司产品，批号1112106；

RPMI 1640培养液：美国Gibco BRL公司产品，批号870532；

阿霉素：深圳万乐药业有限公司产品，批号1103E1。