[发明专利]快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法

权利要求书

1.一种快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将拉曼信号分子和ZEN单克隆抗体结合到胶体金表面，用BSA封闭剩余活性位点，做成金纳米探针；

(2)将玻片进行清洗，再用水虎鱼溶液浸泡，然后依次用硅烷和醛处理，使其硅烷化和醛基化，使表面充满醛基，和抗原ZEN-BSA偶联，最后用BSA进行封闭，得到固定抗原偶联物的基底；其中，玻片每经过一个处理都要用超纯水清洗和氮气吹干；

(3)往空白饲料中添加ZEN标准溶液，混匀，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，最终用PBS缓冲液溶解ZEN，制成一系列浓度梯度的样品液；

(4)将步骤(1)的金纳米探针分别和步骤(3)制成的一系列浓度梯度的样品液同时滴到步骤(2)得到的固定抗原偶联物的基底上，则样品液中的ZEN和基底表面的ZEN-BSA竞争性的和胶体金表面的ZEN单克隆抗体结合；

(5)根据ZEN浓度和拉曼信号强度的对应关系，绘制校正曲线；

(6)取待测样品，用无水甲醇提取ZEN，经过分离和纯化，并用PBS缓冲液稀释，根据该待测样品获得的拉曼信号强度，通过步骤(5)的校正曲线快速得到该待测样品中的ZEN浓度。

2.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的拉曼信号分子为4,4'-联吡啶。

3.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的胶体金的平均粒径为30nm；

步骤(1)中所述的胶体金的制备过程包括如下步骤：在不断搅拌下将100mL1mM的HAuCl₄溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠溶液，等到溶液变成深红色继续沸腾15～20min；最后冷却至常温，得到30nm的胶体金溶液。

4.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的ZEN单克隆抗体在结合到胶体金表面以前，拉曼信号分子首先标记到胶体金的表面。

5.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的水虎鱼溶液为浓硫酸和30％的过氧化氢，按体积比为7:3进行混合得到，所述百分数为体积百分数；

步骤(2)中所述的硅烷为3-氨丙基-三甲氧基硅烷，用浓度为5％～10％的3-氨丙基-三甲氧基硅烷的甲醇溶液，所述百分数为体积百分数；

步骤(2)中所述的醛为戊二醛，用浓度为2％～4％的戊二醛水溶液，所述百分数是体积百分数。

6.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：

步骤(2)所述的用水虎鱼溶液浸泡的时间为25～35min；

步骤(2)所述的用硅烷处理的时间为12～36h；

步骤(2)所述的用醛处理的时间为4～8h；

步骤(2)所述的和抗原ZEN-BSA偶联的时间为2～4h。

7.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的ZEN标准溶液的浓度为0.05～1mg/mL；

步骤(3)中所述的一系列浓度梯度为0、1、10、100和1000pg/mL，其中，0pg/mL为对照；

步骤(4)中所述的金纳米探针和样品液的体积比为1:1。

8.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：

步骤(3)和(6)中所述的用无水甲醇提取，经过分离和纯化，具体步骤如下：取饲料样品，加入无水甲醇与50g/L NaCl溶液后，充分混匀，然后超声提取；抽滤，加入三氯甲烷萃取；分液后，下层的三氯甲烷经无水硫酸钠脱水并收集，将其蒸干，用无水甲醇溶解，然后用PBS缓冲液将其释成一定浓度的饲料样品稀释液。

9.根据权利要求8所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：

所述的饲料样品、无水甲醇和50g/L NaCl溶液的质量体积比为1g：6mL：4mL；

所述的加入三氯甲烷萃取，是分3次进行萃取，每次萃取用的三氯甲烷与饲料样品的体积质量比为4mL：1g；

所述的用无水甲醇溶解，无水甲醇与饲料样品的体积质量比为1mL：5g。

10.根据权利要求1所述的快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的拉曼信号强度是通过显微拉曼光谱仪测得；所述的显微拉曼光谱仪的操作条件为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～60s。