[发明专利]重组大肠杆菌、副鸡禽杆菌抗原蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于家禽传染病疫苗制备技术领域，尤其涉及一种重组大肠杆菌、副鸡禽杆菌抗原蛋白及其应用。 

背景技术

副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、强毒株带有荚膜。1932年De Blieck首先报道了自鼻道和鼻窦黏膜具有急性卡他性炎症、面部水肿和结膜炎的鸡群中首次分离出一种革兰氏阴性杆菌。最初的研究报道指出该病原菌生长条件中既需要X(血红素晶)因子，也需要V(烟酰胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者将其命名为鸡嗜血杆菌(Haemophilus gallinarum)。1962年，Page等人研究发现所有IC病例的分离株生长只需要V因子。因此，有学者提议将只需要V因子的鸡嗜血杆菌命名为—个新种：副鸡嗜血杆菌(H.paragallinarum)，并被广泛接受。近年来，在南非、墨西哥等地已从患鼻炎的鸡中分离到不依赖V因子的副鸡嗜血杆菌菌株。因此，严格按照在体外生长因子需要进行嗜血菌的分类并不科学。2005年，Blackall等将副鸡嗜血杆菌的名称改为副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)。 

副鸡禽杆菌作为鸡的一种重要的呼吸道病原菌，常引起鸡的传染性鼻炎(infectious coryza,IC)，该病在世界范围内广泛传播，给养鸡业造成愈来愈严重的经济损失。目前国内已有许多养鸡场发生该病的报道。从感染部位来看，副鸡禽杆菌感染的是呼吸系统中最前沿的部位--鼻道和鼻窦黏膜，可以说是呼吸道疾病的门户病。这第一屏障被破坏，其他病原的感染率就大大增加。若与其它病原如鸡传染性支气管炎病毒、鸡支原体、鸡传染性喉气管炎等并发感染后引起鸡呼吸道疾病综合征，会给养鸡业造成更大的损失。各种日龄的鸡都易感该菌，常见于13周龄以上的鸡，通常表现为低死亡率和高发病率， 产蛋率下降10％～40％。该病病理变化主要表现在上呼吸道急性卡它性炎症。典型症状是黏液性鼻窦炎，鼻窦黏膜水肿充血、黏膜杆状细胞渗出，并且伴随有异噬性白细胞和巨噬细胞，产生典型的鼻炎病变。临床表现为面部单侧或双侧肿胀、流鼻涕，食欲下降、产蛋率下降。控制该病通常应用抗生素结合综合防治措施，鉴于Apg不同血清型之间缺乏交叉保护，所以在未确定流行的病原菌的血清型之前，常用二价或三价灭活菌苗来免疫预防。由于Apg含有脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)等毒素物质，大量接种所带来毒副作用也会影响鸡的产蛋与生长。 

鸡传染性鼻炎是一种呼吸道传染病，目前主要靠灭活疫苗来控制。灭活疫苗的免疫效果可能与所激发的黏膜抗体相关。研究表明A、B、C三个血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的灭活菌体不存在型间交叉免疫，只存在型内交叉免疫保护。目前国际上普遍使用的灭活疫苗绝大多数都包含了A型和C型，随着国内外陆续发现有大量B型Apg的流行和发生，国际上影响较大的疫苗公司已经开始提供包含A、B、C三种血清型的三价灭活疫苗。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群感染的预防效果大约为70-80％，在其效力检验中由于环境和评价方法的不尽一致可能会有不同的结果。 

常规灭活菌苗在使用过程中遇到了难以突破的难题，在生产中已经出现了型内不能交叉保护的现象。津巴布韦和南非的研究报道中也发现了同样的问题。这样就使副鸡禽杆菌灭活疫苗的使用陷入一个更为复杂的局面，即疫苗公司面临着各地流行的变异株，需要研制出包含各种变异株的菌苗。另一方面，由于副鸡禽杆菌含有LPS等毒素物质，大量接种所带来毒副作用也会影响鸡的产蛋与生长，因此导致了生产上免疫失败时有发生。 

发明内容

本发明的第一个目的是获得一株能够分泌副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的重组大肠杆菌，利用该重组大肠杆菌获得免疫原性更好的保护性抗原蛋白，利用该保护性抗原蛋白制备一种适用于预防或/和防治副鸡禽杆菌的亚单 位疫苗。 

本发明的第二个目的在于将所制备的重组大肠杆菌在制备副鸡禽杆菌亚单位疫苗中的应用。 

为了实现本发明的目的，申请人通过制备获得一株能够分泌副鸡禽杆菌免疫保护性抗原(编码基因登录号-FJ965542.1，其编码基因序列如SEQ No.1所示)的重组大肠杆菌(Escherichia coil)BL21/pGEX-5X-1-18d，该菌株已于2014年3月5日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.8896。