[发明专利]一种用于诊断肝癌的联合型代谢标志物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学，生物化学以及临床医学领域。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，致死率高。中国是世界上肝癌发病率最高的地区之一，大部分肝癌病人主要由肝硬化发展形成。肝癌早期症状不明显，具有进展迅速、易早期转移的特点，在临床上早诊困难、预后效果差。当前，B型超声显像、肿瘤标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的血清含量检查是肝癌筛查的主要方法。然而，B超在小肝癌和肝硬化结节的鉴别上常有困难。甲胎蛋白(AFP)血清水平在诊断肝癌时存在敏感性和特异性较低的缺点，单独用于确诊时的检出率一般只有50％—75％左右。以上方法的局限性极大地限制了肝细胞癌的早期有效诊断，预警作用有限。对于肝细胞癌的早期有效诊断有助于显著提高患者的生存率，因此，开发具有临床早诊潜力的新方法对于降低肝细胞癌的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义。

近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。色谱质谱联用技术是代谢组学的主要研究手段，其检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例，包括基于检测多种氨基酸的新生儿疾病筛查、检测肌氨酸的前列腺癌判别等。由于单一代谢物所受影响因素较多，因此从血清代谢谱中优选出由少数代谢物构成的“联合型的代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P值(Probability)，能够显著改善代谢物对疾病诊断的灵敏度以及特异性。考虑到体内极性代谢物在肿瘤生成及抑制方面的关键调控作用，本发明采用基于毛细管电泳-质谱联用的代谢组学技术和研究方法，检测血清中的极性代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标代谢物，旨在肝细胞癌的诊断中进行应用。

本发明从利用毛细管电泳-飞行时间质谱联用获取的肝癌患者，肝硬化患者以及正常人的血清代谢谱中，经多次优选，确定了基于色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸的联合使用，以作为一种联合型的代谢标志物在判断肝癌中的新用途。该组代谢物分别是体内参与生理过程的重要代谢物。色氨酸参与调控肿瘤的免疫抑制，谷氨酰胺参与肿瘤能量代谢及合成过程，而2-羟基丁酸与氧化应激密切相关，目前尚无将该三种代谢物联合用于肝癌诊断的报道。

发明内容

本发明的目的是针对肝细胞癌早期诊断困难尤其是与肝硬化患者难以区分的临床实际问题，提供了一种基于新的小分子极性代谢物的组合对肝癌患者有效判断的新用途，并提供用于上述小分子代谢物的检测方法。

该代谢物联合标志物包括下列三种代谢物：色氨酸、谷氨酰胺以及2-羟基丁酸。其中，色氨酸在质谱正离子模式下检测到的质核比为205.0972，谷氨酰胺正离子模式下的质核比147.0764；2-羟基丁酸在质谱负离子模式下检测到的质核比为103.0401。

上述三种物质的检测试剂盒如下：

标准品：包括色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸，所述标准品分别用于对应的血清代谢物色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸的定性；用于预处理来自受试者的血清样品的提取液：包含内标物5-10μM的蛋氨酸砜，5-10μM的D-樟脑-10-磺酸钠盐或稳定同位素标记的色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸，及其它稳定同位素标记的内源性小分子代谢物的甲醇溶液；用于毛细管电泳-质谱分离的缓冲液，包括1M甲酸(正离子模式下采用)，50mM的乙酸铵(PH值以氨水调节至8.5，负离子模式下采用)。

计算受试者血清样品中的联合标志物变量P的方法如下：

1)受试者样本处理：以血清样品的提取液处理来自受试者的血清样本，然后进一步提取极性代谢物。

2)以毛细管电泳-质谱对经步骤1)处理的血清样本进行分离，并由质谱检测。

3)经毛细管电泳-质谱分析后，所得电泳峰强度与分别与内标物比较，正离子与蛋氨酸砜(或同位素内标)，负离子与D-樟脑-10-磺酸钠盐(或同位素内标)相比较，获得上述三种物质的相对浓度。

4)进一步将色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸回归为联合标志物变量P，二元逻辑回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(14.315+0.776a-13.437b-0.829c)})