[发明专利]靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用。

背景技术

干扰素的抗病毒作用是干扰素分子结合到干扰素受体之后，向细胞核传播信号，2,5-腺苷酸合成酶和蛋白激酶被活化，最后阻断病毒蛋白的翻译和病毒RNA的合成。干扰素受体是干扰素连锁反应的初始蛋白。人的干扰素受体分Ⅰ型干扰素受体(该受体与干扰素α、β结合)及Ⅱ型干扰素受体(与干扰素γ结合产生特异的敏感性)。此外，已证实Ⅱ型干扰素受体对干扰素α、β也有一定的敏感性，干扰素α亚型和β亚型均对干扰素受体敏感。

IFN生物效应的发挥，需要跟相应的信号受体结合。根据IFN的分类，干扰素受体分为：结合I型干扰素的I型干扰素受体和结合II型干扰素受体。人I型干扰素受体基因定位于第21号染色体上，分布于细胞表面，至少含有两个亚单位，命名为α(IFNAR-1)和β(IFNAR-2)，它们属于II类细胞因子受体家族。IFN-α/β通过吸附细胞表面受体IFNAR-1和IFNAR-2发挥作用，蛋白酪氨酸激酶中的Tyk2和Jak1分别与IFNAR-1和IFNAR-2相关。

为了更好地解析IFNAR2基因的生物学功能和挖掘其在临床上的应用价值，进一步阐明IFNAR2基因的生物学功能成为必要。目前，运用RNA干扰的方法研究基因功能成为了基因功能研究中最重要的手段之一，但是针对IFNAR2基因干扰的研究尚未见任何指导。

RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。RNAi所诱导的特异性基因沉默现象，是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。

RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。目前获得siRNA产物的方法主要包括以下五种：1)化学合成；2)体外转录；3)RNase III降解dsRNA；4)siRNA表达载体；5)PCR表达框。在以上方法中，化学合成、体外转录和RNase III降解dsRNA均是在体外制备得到siRNA，siRNA需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将siRNA转染进入细胞是成功的关键。siRNA表达载体可以在克隆菌株中大量扩增，还可以使用常规的质粒DNA转染方法，将siRNA表达载体转染入细胞，在细胞内加工生成siRNA。而且siRNA表达载体是唯一可以进行长期研究的方法，因该方法中克隆到的带抗生素标记的载体可以在细胞中持续表达，进而抑制靶基因的表达，持续时间久，并且可以做稳定细胞系的筛选。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供靶向IFNAR2基因的siRNA。本发明通过大量筛选和实验工作得到靶向IFNAR2基因的siRNA。

本发明的另一目的在于提供表达siRNA的表达载体。

本发明的另一目的在于提供上述表达载体的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述siRNA及表达载体在抑制IFNAR2基因表达中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：靶向IFNAR2基因的siRNA，其编码所述siRNA的DNA序列选自如下核苷酸序列：

siE1:5′-CTAACAGATGTGTGGATAA-3′(SEQ ID No.7)；

siE2:5′-CGAATAAAGGGAAACATCA-3′(SEQ ID No.8)；

siE3:5′-GATGAATCTTGCACTTTAA-3′(SEQ ID No.9)；