[发明专利]带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株及其应用，及基于肿瘤侵袭性新靶标PNC的抗转移中药单体的筛选模型及其应用。

背景技术

我国乳腺癌发病率逐年升高，男性乳腺癌患者比例亦不断上升。虽然外科手术和放化疗手段对原发性乳腺癌的临床治疗已初现成效，但晚期乳腺癌导致的转移仍是危及生命的重要问题。而目前尚无明确有效的抗转移药物，传统化疗药物如阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、氟脲嘧啶脱氧核苷酸等，在杀伤肿瘤细胞的同时，也对机体正常细胞造成严重伤害，具有明显的毒副作用。因此探索肿瘤治疗的新靶点，并开发毒副作用较低的化疗新药，对于提高肿瘤治疗的靶向性以及减少肿瘤化疗的副反应具有重要意义。

侵袭性(浸润-转移)作为恶性肿瘤的重要标志之一，是导致癌症患者死亡的主要原因。而抗癌新药，尤其是抗转移药物长期处于市场需求“饥渴状态”。近来研究发现，PNC(perinucleolar compartment)是一个与肿瘤侵袭性密切相关的细胞核亚结构，其主要由MRP等非编码RNA和PTB、CUG-BP1等RNA结合蛋白所组成。由于肿瘤细胞核中PNC比例与乳腺癌侵袭性呈正相关，并且与患者预后密切相关。因此以PNC为探针的高转移性乳腺癌细胞模型的建立，对于抗转移新药的高通量筛选具有潜在优势。

我国传统的中药，例如灵芝、当归、黄芪、三七等，因其抗肿瘤效应、放化疗增敏作用以及在减轻放化疗毒副方面独具效果而越来越受到人们的重视。但中药作为一个复杂组分其具体的作用机制尚不明确，目前，随着对中药提取物，尤其是中药单体的抗肿瘤机制研究的不断深入，中药单体在肿瘤治疗中的前景日益受到关注。已有研究显示中药单体在乳腺癌治疗中的作用，但面对庞大的中药单体库，如何简便高效地选择出具有降低乳腺癌侵袭性潜能的中药单体，又是一个亟待解决的重要问题，对于药物的选择性开发至关重要。因此基于新型肿瘤转移分子标记物PNC的高转移性乳腺癌细胞模型的建立，对于从传统中药中发掘具有抗乳腺癌转移作用的中药单体，或以此为先导化合物的结构修饰型药物的开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是通过建立基于新型肿瘤转移分子标记物PNC的药物体外筛选模型，为抗肿瘤转移作用的中药单体的选择性开发提供技术平台。

首先，本发明提供了一种带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株及其构建方法。

带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株，通过GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染高转移性乳腺癌细胞株构建。

带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的构建方法：包括如下步骤：

1)制备高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231M；

2)构建带GFP标记的PTB表达质粒GFP-PTB：通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamH1位点处插入GFP表达质粒pEGFP-C1，获得带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒；

3)步骤2)的GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染步骤1)的高转移性的乳腺癌细胞株，得到带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株，并通过G418筛选获得稳转细胞株MDA-MB-231M-GFP-PTB。

优选的，所述在步骤1)为通过乳腺癌细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，重复5次，获得高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231M。

另外，本发明还提供了带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的应用。

带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株用于制备乳腺癌诊断试剂。

带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株用于制备乳腺癌药物筛选模型。

本发明还提供了一种抗转移中药单体的筛选模型及其构建和使用方法。

一种基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型，所述筛选模型采用带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株，通过中药单体对带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的PNC抑制率进行筛选。

基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的构建方法，包括如下步骤：

1)通过肿瘤细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，如此重复5次，获得高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231M；

2)通过PTB抗体的免疫荧光实验，检测上述高转移乳腺癌细胞株中的PNC比例，3株细胞的PNC比例均在95％以上；