[发明专利]带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株及其应用

权利要求书

1.带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株，其特征在于：通过GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染高转移性乳腺癌细胞株构建。

2.权利要求1所述的带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的构建方法：包括如下步骤：

1)制备高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231M；

2)构建带GFP标记的PTB表达质粒GFP-PTB：通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamH1位点处插入GFP表达质粒pEGFP-C1，获得带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒；

3)步骤2)的GFP-PTB融合蛋白表达质粒转染步骤1)的高转移性的乳腺癌细胞株，得到带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株，并通过G418筛选获得稳转细胞株MDA-MB-231M-GFP-PTB。

3.根据权利要求2所述的带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的构建方法，其特征在于：所述在步骤1)为通过乳腺癌细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，重复5次，获得高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231M。

4.权利要求1所述的带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株用于制备乳腺癌诊断试剂。

5.权利要求1所述的带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株用于制备乳腺癌药物筛选模型。

6.一种基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型，其特征在于：所述筛选模型采用带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株，通过中药单体对带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的PNC抑制率进行筛选。

7.权利要求6基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的构建方法，包括如下步骤：

1)通过肿瘤细胞株原位接种-分离淋巴结转移灶-体外培养得到转移性肿瘤细胞株-再次原位接种，如此重复5次，获得高转移性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231M；

2)通过PTB抗体的免疫荧光实验，检测上述高转移乳腺癌细胞株中的PNC比例，3株细胞的PNC比例均在95％以上；

3)带GFP标记的PTB表达质粒(GFP-PTB)的构建：通过高保真DNA聚合酶以PCR法扩增人PTB cDNA序列，扩增后的片断在HindIII和BamH1位点处插入GFP表达质粒pEGFP-C1，即得到带GFP标记的PTB融合蛋白表达质粒；

4)上述GFP-PTB融合蛋白表达质粒通过2000分别转染步骤1中的3株细胞，并通过G418筛选2-3周获得稳转乳腺癌细胞株；MDA-MB-231M-GFP-PTB；

5)采用荧光显微镜验证上述稳转细胞株中的PNC比例，与步骤2的PTB免疫荧光检测结果一致，即得到可用于抗转移中药单体筛选的带GFP标记PNC的高转移性肿瘤细胞模型。

8.权利要求5所述的基于PNC的抗转移中药单体的筛选模型的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)采用CCK8法分析备选中药单体对带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株的生长抑制情况，计算48h时间点的GI50％和GI99％药物浓度；

2)带GFP标记PNC的高转移性乳腺癌细胞株爬片过夜后，分别加入GI50％和GI99％浓度的中药单体作用24小时后，用4％多聚甲醛固定，并水洗封片后于镜下观察；

3)采用荧光显微镜检测中药单体作用后的PNC比例，每次计数100个细胞，计数3次后取平均值；或采用激光共聚焦显微镜成像后，配合Stereo Investigator软件计数中药单体作用后的肿瘤细胞PNC比例；

4)计算PNC抑制率：PNC抑制率＝(助溶剂DMSO组的PNC比例-中药单体组的PNC比例)/助溶剂DMSO组的PNC比例×100％，再行统计分析；

5)以中药单体的PNC抑制率作为筛选依据：在GI50％浓度时达到30％以上PNC抑制率的作为优先选择，以GI99％浓度达到30％以上PNC抑制率的作为第二选择。