[发明专利]一种医药级重组人血清白蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明阐述了一种通过巴斯德毕赤酵母高效表达的基因重组人血清白蛋白（recombinant human serum albumin, rHSA）纯化方法，该方法涉及到发酵上清液的浓缩、重组蛋白质在电场下进行分离以及各种特异性亲和层析的应用。

背景技术

人血白蛋白（HSA）是人体血液中最为重要的成分，含量达到42g/L的水平。其主要功能是维持血液渗透压的平衡、运输人体营养物质、保持细胞中内含物的稳定性等多种功能。在临床上多用于治疗休克、烧伤、创伤、低蛋白血症、急性血容量减少、癌症化疗、腹水、癌症晚期及提高老龄人的机体免疫力等，是临床上极其重要的一线用药，也是国家战略储备药物之一，用于地震、瘟疫和战争等突发事件。人血白蛋白（HSA）在医药工业生产中广泛用于疫苗等生物制品的培养基或保护剂（辅料）。目前国内生产人血清白蛋白（pHSA）只能依靠从人血清中提取。由于我国血源紧张，而且普遍存在血液中携带诸如乙肝病毒、艾滋病毒等严重安全性问题，因此人血白蛋白产量严重受限、生产成本居高不下。

在DNA重组技术出现以前，白蛋白药物的生产主要是从人的血液中通过低温乙醇法（Cohn法）和柱层析法进行提取，在生产过程中存在原料分散、供应紧张、被某些病原体，如肝炎病毒、艾滋病毒污染等缺点。据2000年4月7日世界卫生组织的统计：全球超过一半国家没有对献血者的血液进行彻底检查，致使每年受血者感染爱滋病、肝炎、疟疾和梅毒等疾病的人数超过1000万。尤其爱滋病的传播引起了世界性恐慌，到2005年仅被爱滋病病毒感染的人数就上升到4030万，中国感染者接近100万，是增长最快的国家之一。

由于管理和检测技术上的漏洞，易导致部分含有病原体污染的血浆进入血制品的生产领域，进而可能使白蛋白制品受到污染。为了确保产品质量，国家每年投入4000多万元用于血浆检测和跟踪管理，同时由于血液供应紧张，制备成本也在逐年上升。通过基因工程技术不仅可以解决原料供应紧张的问题，提高人血白蛋白药物的产量，而且可以消除病毒污染，为安全用药提供保障。

基因重组蛋白技术是将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集蛋白。目前该技术主要以酵母做为蛋白表达或生产系统。因为酵母来源广、相对价廉、组成简单，所以与人血清来源的白蛋白相比，重组白蛋白的生产不受血浆供应的制约、纯化过程简单。基因重组人血清白蛋白与人血浆白蛋白的结构基本一致，临床疗效和安全性也几乎相同。采用基因重组技术生产白蛋白，不仅可以避免血源枯竭和血液制品污染的问题，而且可以实现大规模生产。在当前白蛋白持续供不应求的市场条件下，开发基因重组白蛋白具有良好的市场前景。

从1981年，Genentech公司Lwan等人首次报道了重组人血清白蛋白cDNA序列，并首次采用色氨酸启动子构建了第一个重组人血白蛋白的表达载体pHSA，并在大肠杆菌中获得了成功表达。此后人们对人血白蛋白的结构和表达进行了深入的研究。目前白蛋白基因已经被克隆到细菌、真菌、植物以及动物中进行表达。应用大肠杆菌表达系统表达的rHSA是一个以甲硫氨酸为N端的人血白蛋白前源蛋白，由于表达产物存在于细胞质中并形成包涵体，需要细胞破壁、分离、复性和纯化，因HSA有17.5对二硫键，结构复杂，难以正确复性，同时由于HSA分子量较大，在原核生物中表达量不高(毫克级)，没有工业化价值。在动、植物表达系统中也进行了重组人血清白蛋白的表达。通过微注射法把人血清白蛋白基因片段注射到受精卵中或细胞外植体并己在大鼠、小鼠、山羊、奶牛等转基因动物中得到表达。重组人血清白蛋白通过转基因技术在马铃薯烟叶中也得到成功的分泌表达。其中转基因动物具有表达量高、容易加工处理等，具有诱人的前景，但转基因动物来源的rHSA仍然存在病毒污染的危险，技术也不成熟，目前仍处于实验阶段。

许多研究者用真核生物酵母，如啤酒酵母、毕赤酵母、克鲁维酸酵母、栗酒裂殖酵母、汉逊酵母等宿主菌来进行重组白蛋白的表达。酵母作为真核生物具有能对所表达的蛋白进行翻译后修饰，易于大规模培养，可将目的产物直接分泌到培养基内，培养基的氧化环境有利于二硫键形成和天然构象蛋白质的表达。毕赤酵母作为宿主菌还具有培养方法简便，内毒素含量低，表达水平高的特点，易于实现工业化。目前，日本三菱制药公司（原绿十字医药公司）已经成功在毕赤酵母细胞中表达rHSA，纯化到了医药级的水平，并于2007年获得批准上市。但是，日本三菱制药公司纯化rHSA，由于纯化成本高，工艺线路长，操作复杂，工人技术要求高等缺陷。