[发明专利]一种鉴定希瓦氏菌的表面增强拉曼散射方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有金属还原活性的希瓦氏菌的鉴定方法，特别涉及一种利用希瓦氏菌自身金属还原能力制备纳米金属的拉曼光谱鉴定方法。

背景技术

希瓦氏菌是一种异化铁还原菌；异化铁还原被认为生地球上最早的呼吸形式之一，多种古细菌和真菌具有还原Fe(Ⅲ)的能力，被称为铁还原菌。在异化铁还原过程中，微生物利用外界的Fe(Ⅲ)作为呼吸链末端电子受体，氧化体内的基质(电子供体)，实现电子在呼吸链上的传递，从而使Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，此过程所释放出来的能量又被微生物所捕获，满足去生长发育的需要。

目前，微生物的检测方法主要有：传统的增殖、分离和血清、生化鉴定方法。其中，酶联免疫吸附法(ELISA)，主要通过细菌表面抗原和试剂盒中的特异性结合作用；聚合酶链式反应(PCR)法，以核酸分子为探针高灵敏的检测技术等等。这些方法虽然都较为灵敏、稳定，但是由于需要较长时间进行样品前处理，给快速检测带来了一些问题，因此，快速简易、提高检测效率、降低检测限是我们将要研究内容。表面增强拉曼(SERS)技术，作为一种光谱技术，是1974年由Fleischmann等人发现的，由于这种技术具有高灵敏性、简便前处理、低扫描时间和水干扰小的特点，已经被大量用于实际检测中。

在检测微生物领域，SERS已经表现出现对于传统检测方法的突出的优越性，特别是在增强底物与细菌的结合方式上，SERS独特的技术性和多样的增强制备手段为成功实现SERS超灵敏、快速检测微生物打下了坚实的基础。

增强底物与细菌的结合包括细胞外增强和细胞内增强。目前，细胞外的SERS增强手段已经比较丰富和成熟。目前有应用的SERS增强方式，可以分为三个部分：(1)利用纳米技术获得SERS活性基底，常用的为一些贵金属纳米粒子所构成的纳米胶体，然后将制好的菌体与纳米胶体混合，细菌就能够吸附或者靠近金属表面，使得拉曼信号得到增强。从获得的表面增强拉曼光谱中可以分析得出，各种细菌所独有的表面成分或特殊形态学结构信息。金属溶胶体系具有制备简单和SERS增强效果好等优点，其表面增强拉曼散射效应与溶胶纳米粒子的种类、粒径、粒子间距、激发光的波长等因素有关。但由于颗粒尺寸不均一和形状的无规则性而导致较差的稳定性和重现性，而且有研究表明在鉴别同种菌种的不同菌株，甚至是部分不同菌种的细菌时会得到相同的拉曼光谱图。(2)使细菌分布在银和金等纳米粒子构成的活性膜上得到增强。(3)形成有序纳米粒子自组装阵列使胞外拉曼信号得到增强。(2)和(3)这两种细胞外SERS增强虽然使得重现性和灵敏度都有很大的改善，但是制备基底的过程相对(1)要复杂很多。

Roger M.Jarvis和Royston Goodacre2008年3月26日在化学会评论发表用SERS表征和鉴别细菌，但是该文明确指出了用化学方法合成的纳米银难以将有的菌区分开，(Roger M.Jarvis^*and Royston Goodacre，Characterisation and identification of bacteria using SERS，Received14th January2008，First published as an Advance Article on the web26th March2008，DOI:10.1039/b705973f)。并且，纳米银的合成较为复杂，所需成本也比较高，比如，用还原剂还原银的化合物而制备纳米银粉的方法，是在溶液中加入分散剂，以水合肼、硼氢化钠、次亚磷酸钠、葡萄糖、抗坏血酸、双氧水等作还原剂还原银的化合物反应中，分散剂可控制反应的过程，降低银粒子的表面活性，从而控制生成的银微粒在钠米数量级。常用的分散剂有PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、明胶等。

另外，目前还没有文献报道用拉曼方法鉴定该菌是否是金属还原活性菌，从而把金属还原活性菌与非金属还原菌鉴别和区别开来，也无文献鉴定和区分不同的具有金属还原活性的菌。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于，提出一种利用希瓦氏菌的自身金属还原能力将金属还原能力将金属离子还原成纳米金属，采用拉曼光谱对希瓦氏性菌进行检测，该方法具有灵敏度高易于操作，检测速度快，成本低廉，克服了鉴别不同菌种的细菌和同种菌种的不同菌株用金属溶胶做增强试剂分辨不清的问题。