[发明专利]自然无血凝性水貂肠炎病毒株MEV-NH及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物制品技术领域，具体涉及一种自然无血凝性水貂肠炎病毒株MEV-NH及其制备方法和应用。

背景技术

1949年，水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus)在加拿大水貂饲养场流行，给养貂业造成了巨大损失。通过粪便滤液人工感染试验，证实是一种病毒性传染病，称为貂肠炎病毒。有学者证实，猫泛白细胞减少症病毒(FPV)的抗血清能防止感染，FPV疫苗也可以预防貂病毒性肠炎。1967年，在感染貂脏器细胞培养物中分离到了MEV，伴随着病毒增殖，出现短暂的核内包涵体和不同程度的细胞病变。MEV可在猫肾细胞系中生长，接种4～6天后，病毒达最高滴度。无论MEV的形态和理化学特性还是其抗原性、基因结构特点都与FPV十分近似，常规血清学方法不能将两者区分开。

貂病毒性肠炎的暴发通常是季节性的，一般发生于7、8、9月份，粪口传播是最主要的传播途径。由于MEV像其他细小病毒一样对理化因素具有强大抵抗力，可通过饲养人员、流动人员、设备、工具和苍蝇等传播。一旦MEV传入貂场，总是先感染就近貂，然后传播到整个貂场。一般持续2～3周。貂病毒性肠炎潜伏期为4～8天，症状与猫泛白细胞减少症近似。死亡率10～80％，幼貂死亡率更高。人工感染潜伏期为4～6天，症状是腹泻、粪便稀软，同时粪便中出现大量粘液，病貂拒食，脱水，粪便呈水样，继之死亡。病变主要限于肠道及淋巴结，小肠呈急性卡他性出血性肠炎，内容物水样恶臭，肠系膜淋巴结肿胀。

病毒粒子外观与FPV、CPV相同，直径20～24nm，核酸由单股DNA组成，长约5000nt。绝大多数水貂肠炎病毒，在4℃下对猪红细胞有凝集作用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种自然无血凝性水貂肠炎病毒株MEV-NH及其制备方法和应用。

本发明的自然无血凝性水貂肠炎病毒株MEV-NH，该水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus)NH于2014年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8858。其VP2基因序列如序列表SEQ IE NO 3所示；其VP2氨基酸序列如序列表SEQ IE NO 4所示。

本发明的自然无血凝性水貂肠炎病毒株MEV-NH的制备方法，该方法的条件和步骤如下：

采用山东省某貂场疑似水貂病毒肠炎发病貂的稀粪，将此病料用无血清MEM(青霉素、链霉素浓度各为2000U/mL)制成10％(v/v)悬液，冻融1次，以5000r/min离心10min，取上清，0.22μm滤膜除菌，-80℃保存用于病毒分离。将处理好的病料上清液按3％的比例同步接种于CRFK细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4～5天，观察细胞病变(CPE)。病毒接种细胞CPE达80％左右，收取病毒培养物，反复冻融3次，用收获培养物接种细胞进行病毒传代得到水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus)NH。

本发明的自然无血凝性水貂肠炎病毒株MEV-NH作为验证疫苗免疫原性的检验强毒株的应用，采用1～2月龄健康水貂10只，随机选取5只作为免疫组，每只各注射接种1头份疫苗，剩余5只作为对照组，每只各注射生理盐水2ml；21天后，所有10只水貂都接种水貂肠炎病毒MEV-NH流行株细胞培养物1ml，连续观察14天，对照组水貂全部表现出水貂病毒性肠炎症状，而免疫疫苗组水貂全部未表现出水貂病毒性肠炎症状，说明该疫苗能够对水貂产生无血凝性MEV-NH流行株的免疫保护作用。

本发明的有益效果是：

本发明中所发现并分离的水貂肠炎病毒株MEV-NH，在不同的温度(4℃及20℃)，不同的PH值(PH值5.0至8.0)条件下都不会使多种动物(鸡，豚鼠，猪，恒河猴及人O型血)的红细胞发生凝集。水貂肠炎病毒株MEV-NH全基因组序列在GeneBank的登陆号为：JX535284。水貂肠炎病毒株MEV-NH为天然丧失血凝性，并非由细胞传代过程中丧失。通过对原始粪拭子样品检测无血凝性，粪拭子上清接种传代细胞可出现典型细小病毒病变，通过免疫荧光和全基因测序，证实为水貂肠炎病毒。

水貂肠炎病毒株MEV-NH为自然变异，天然丧失血凝性，对猪红细胞不产生凝集作用。现有水貂病毒肠炎疫苗能否对变异的无血凝性水貂肠炎病毒流行株起到保护作用，可通过免疫动物后，使用水貂肠炎病毒MEV-NH株攻毒检验。

具体实施方式